通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法技术

本发明专利技术涉及通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，属于生物技术领域。本方法首先以CGMCC No.0943枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株，以大肠杆菌‑枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pMAD为骨架构建一个基因过表达载体pCBS‑LPComAR，利用同源重组原理，通过双交换过程在淀粉酶位点敲入枯草芽孢杆菌fmbJ基因组comA基因的方法构建了一个高产bacillomycin D菌株，命名为fmbJcomA。经过高效液相色谱分析，确定改良菌株产bacillomycin D的能力大幅度提高。

Method of Increasing the Production of Antifungal Peptide Baillomycin D by Overexpression of ComA Gene

The invention relates to a method for increasing the yield of bacillomycin D by overexpressing comA gene, belonging to the field of biotechnology. Firstly, a gene overexpression vector pCBS LPComAR was constructed using CGMCC No. 0943 Bacillus subtilis fmbJ as the starting strain and E. coli and Bacillus subtilis shuttle cloning vector pMAD as the skeleton. Based on the principle of homologous recombination, a high-yielding bacomycin D was constructed by knocking Comilla gene of Bacillus subtilis fmbJ genome into amylase site by double-exchange process. The strain was named fmbJcomA. The ability of producing bacillomycin D of the improved strain was greatly improved by high performance liquid chromatography analysis.

【技术实现步骤摘要】
通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycinD产量的方法一、
本专利技术通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycinD产量的方法，具体涉及通过过表达comA基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽bacillomycinD产量的方法，属于生物
二、
技术介绍
作为促进植物生长的根际微生物，芽孢杆菌属在可持续农业方面显示出光明的前景。它们不仅能分泌促进植物生长的物质，还能产生许多具有抗菌活性的次级代谢产物。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)fmbJ是一种可以分泌bacillomycinD、surfactin、fengycin等抗菌脂肽物质的芽孢杆菌。其中，bacillomycinD属于iturin家族成员，是通过非核糖体多肽合成酶催化形成的由一个14-17个C的β-氨基脂肪酸和7个氨基酸缩合而成的环状脂肽结构。它对黄曲霉、赭曲霉以及禾谷镰刀菌等具有很强的抑制作用。其中，真菌毒素是霉变食品的最大危害，严重威胁人类健康。而化学合成防腐剂具有食品安全的风险，研究和开发新的天然安全的农产品保鲜剂在保障粮食和食品安全以及防治真菌污染等方面具有重要的意义。但实际本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，包括以下步骤：(1)comA基因过表达载体pCBS‑LPComAR的构建设计引物ComA‑F和ComA‑R，以CGMCC No.0943枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有酶切位点KpnI和NcoI的完整的comA基因657bp；设计引物PamyJ‑F和PamyJ‑R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和KpnI酶切位点的完整fmbJ淀粉酶启动子基因片段349bp；设计引物L‑amy‑F和L‑amy‑R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DN...

【技术特征摘要】
1.通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycinD产量的方法，包括以下步骤：(1)comA基因过表达载体pCBS-LPComAR的构建设计引物ComA-F和ComA-R，以CGMCCNo.0943枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有酶切位点KpnI和NcoI的完整的comA基因657bp；设计引物PamyJ-F和PamyJ-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和KpnI酶切位点的完整fmbJ淀粉酶启动子基因片段349bp；设计引物L-amy-F和L-amy-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和BglII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段1012bp；扩增得到的三个基因片段分别克隆至pMD19-T载体，转化大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5a，经验证、测序正确后，分别命名为pComA-T、pPamyJ-T、pLamy-T，于-20℃条件下保存备用；pComA-T用KpnI和NcoI双酶切后获得comA片段，与经过相同双酶切处理的pMAD载体，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS-ComA载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；pPamyJ-T用SalI和KpnI双酶切后获得PamyJ片段，与经过相同双酶切处理的pCBS-ComA载体，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS-PComA载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；pLamy-T用SalI和BglII双酶切后获得Lamy片段，与经过SalI和BamHI双酶切处理的pCBS-PComA载体，利用BglII和BamHI为同尾酶的原因，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆兆新，孙静，别小妹，吕凤霞，赵海珍，李金良，
申请(专利权)人：南京农业大学，南京福斯弗瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32