通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法技术

本发明专利技术涉及通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，属于生物技术领域。本方法首先以CGMCC No.0943枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株，以大肠杆菌‑枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pMAD为骨架构建一个基因过表达载体pCBS‑LPComAR，利用同源重组原理，通过双交换过程在淀粉酶位点敲入枯草芽孢杆菌fmbJ基因组comA基因的方法构建了一个高产bacillomycin D菌株，命名为fmbJcomA。经过高效液相色谱分析，确定改良菌株产bacillomycin D的能力大幅度提高。

Method of Increasing the Production of Antifungal Peptide Baillomycin D by Overexpression of ComA Gene

The invention relates to a method for increasing the yield of bacillomycin D by overexpressing comA gene, belonging to the field of biotechnology. Firstly, a gene overexpression vector pCBS LPComAR was constructed using CGMCC No. 0943 Bacillus subtilis fmbJ as the starting strain and E. coli and Bacillus subtilis shuttle cloning vector pMAD as the skeleton. Based on the principle of homologous recombination, a high-yielding bacomycin D was constructed by knocking Comilla gene of Bacillus subtilis fmbJ genome into amylase site by double-exchange process. The strain was named fmbJcomA. The ability of producing bacillomycin D of the improved strain was greatly improved by high performance liquid chromatography analysis.

【技术实现步骤摘要】
通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycinD产量的方法一、
本专利技术通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycinD产量的方法，具体涉及通过过表达comA基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽bacillomycinD产量的方法，属于生物
二、
技术介绍
作为促进植物生长的根际微生物，芽孢杆菌属在可持续农业方面显示出光明的前景。它们不仅能分泌促进植物生长的物质，还能产生许多具有抗菌活性的次级代谢产物。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)fmbJ是一种可以分泌bacillomycinD、surfactin、fengycin等抗菌脂肽物质的芽孢杆菌。其中，bacillomycinD属于iturin家族成员，是通过非核糖体多肽合成酶催化形成的由一个14-17个C的β-氨基脂肪酸和7个氨基酸缩合而成的环状脂肽结构。它对黄曲霉、赭曲霉以及禾谷镰刀菌等具有很强的抑制作用。其中，真菌毒素是霉变食品的最大危害，严重威胁人类健康。而化学合成防腐剂具有食品安全的风险，研究和开发新的天然安全的农产品保鲜剂在保障粮食和食品安全以及防治真菌污染等方面具有重要的意义。但实际中，其并未在可持续农业以及环境保护中广泛应用，究其原因，是由于它的生产成本高，因此，提高其产量便成为降低其生产成本的关键问题。目前，国内外研究成果显示，提高bacillomycinD产量的方法主要是筛选优良菌株，以及优化其发酵条件，而很少采用分子生物学手段对菌种进行改良的方法来提高bacillomycinD产量。但随着对抗菌肽合成分泌机制研究的日益深入，已经逐渐开始采用分子生物学技术，通过改造其合成分泌中信号通路等方法来对原始菌种进行基因改良，从而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。ComA基因(GeneID:5462124)的表达产物是双组份调控系统中的ComA调控蛋白。这个系统涉及磷酸化以及DNA结合活性，在抗菌物质的形成中发挥着重要的作用，相关研究表明，ComA调控蛋白对于抗菌物质的合成具有一定的促进作用。本方法首先以枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株，以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pMAD为骨架构建一个基因过表达载体pCBS-LPComAR，利用同源重组原理，通过双交换过程在淀粉酶位点敲入枯草芽孢杆菌fmbJ基因组comA基因的方法构建了一个高产bacillomycinD菌株fmbJcomA。三、
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是利用分子生物学技术，构建comA基因过表达载体，经过电转化通过同源重组在淀粉酶位点将枯草芽孢杆菌fmbJ基因组中comA基因敲入，从而构建一种高产抗菌肽bacillomycinD的枯草芽孢杆菌菌株fmbJcomA的方法。技术方案1、通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycinD产量的方法，其特征在于：(1)comA基因过表达载体pCBS-LPComAR的构建根据枯草芽孢杆菌comA基因设计引物ComA-F和ComA-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有酶切位点KpnI和NcoI的完整的comA基因(657bp)；根据枯草芽孢杆菌淀粉酶的启动子设计引物PamyJ-F和PamyJ-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和KpnI酶切位点的完整fmbJ淀粉酶启动子基因片段(349bp)；根据枯草芽孢杆菌淀粉酶基因设计引物L-amy-F和L-amy-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和BglII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段(1012bp)；扩增得到的三个基因片段分别克隆至pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5a，经酶切验证、测序正确后，分别命名为pComA-T、pPamyJ-T、pLamy-T，于-20℃条件下保存备用；PCR扩增体系如下：PCR程序为95℃3min；35个循环：95℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃10min；pComA-T用KpnI和NcoI双酶切后获得comA片段，与经过相同双酶切处理的pMAD载体，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS-ComA载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；pPamyJ-T用SalI和KpnI双酶切后获得PamyJ片段，与经过相同双酶切处理的pCBS-ComA载体，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS-PComA载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；pLamy-T用SalI和BglII双酶切后获得Lamy片段，与经过SalI和BamHI双酶切处理的pCBS-PComA载体，利用BglII和BamHI为同尾酶的原理，消除载体上的BamHI酶切位点，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS-LPComA载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；设计同源重组引物R-amy-F和R-amy-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有BglII和NcoI酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段(952bp)以及pCBS-LPComA载体的部分片段(30bp)，与经过BglII和NcoI双酶切处理的pCBS-LPComA载体，用同源重组酶连接，构建pCBS-LPComAR载体，酶切验证正确后，转化大肠杆菌JM110，用于进一步的电转化。2)过表达comA基因枯草芽孢杆菌菌株的获得以枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的comA基因过表达载体pCBS-LPComAR转化入枯草芽孢杆菌fmbJ，在基因组淀粉酶位点发生双交换，在红霉素抗性的LB平板上不长，但在无抗性的LB平板能够生长，且PCR验证出现PamyJ+comA的基因片段，此时获得的菌株即为过表达comA的菌株，命名为fmbJcomA，该菌株既包括的原本基因组上的comA基因，且在淀粉酶位点处插入了同样的comA基因，成为过表达comA基因的突变菌株，即为所得到的菌株。以上所述过表达comA基因的枯草芽孢杆菌菌株fmbJcomA可以在生产抗菌脂肽中应用，生产抗菌脂肽bacillomycinD产品。有益效果枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)不仅能分泌促进植物生长的物质，还能产生许多具有抗菌活性的次级代谢产物，其中抗菌肽占主导地位。由于它具有广泛的抗菌活性、生物可降解性以及毒性低等特点，因此，愈来愈受到人们的重视。特别针对目前农药残留、化学食品和饲料添加剂对于食品安全的严重影响，研究天然的抗菌物质对农产品安全生产具有重要的现实意义。国内外针对抗菌肽的发酵工艺和分离技术开展了大量的研究。虽然通过发酵工艺的优化能够在一定程度上提高抗菌肽的生产水平，但发酵产量仍然是大规模工业化生产的难题。因此，在分子生物学水平上，采用基因工程技术对菌种进行定向改造将成为一种提高抗菌肽产量的新手段。本专利技术通过分子生物学技术，成功构建一株高产bacillomycinD菌株fmbJcomA。与原始菌株fmbJ相比，经过菌种改良的菌株fmbJcomA合成分泌bacillomycinD能力大幅度提高，产量从218.3±21.8mg/L提高到386.6±15.7mg/L，提高了1.77倍。此外，该专利技术还揭示了ComA调控蛋白对bacillomycinD合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，包括以下步骤：(1)comA基因过表达载体pCBS‑LPComAR的构建设计引物ComA‑F和ComA‑R，以CGMCC No.0943枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有酶切位点KpnI和NcoI的完整的comA基因657bp；设计引物PamyJ‑F和PamyJ‑R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和KpnI酶切位点的完整fmbJ淀粉酶启动子基因片段349bp；设计引物L‑amy‑F和L‑amy‑R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和BglII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段1012bp；

【技术特征摘要】
1.通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycinD产量的方法，包括以下步骤：(1)comA基因过表达载体pCBS-LPComAR的构建设计引物ComA-F和ComA-R，以CGMCCNo.0943枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有酶切位点KpnI和NcoI的完整的comA基因657bp；设计引物PamyJ-F和PamyJ-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和KpnI酶切位点的完整fmbJ淀粉酶启动子基因片段349bp；设计引物L-amy-F和L-amy-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和BglII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段1012bp；扩增得到的三个基因片段分别克隆至pMD19-T载体，转化大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5a，经验证、测序正确后，分别命名为pComA-T、pPamyJ-T、pLamy-T，于-20℃条件下保存备用；pComA-T用KpnI和NcoI双酶切后获得comA片段，与经过相同双酶切处理的pMAD载体，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS-ComA载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；pPamyJ-T用SalI和KpnI双酶切后获得PamyJ片段，与经过相同双酶切处理的pCBS-ComA载体，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS-PComA载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；pLamy-T用SalI和BglII双酶切后获得Lamy片段，与经过SalI和BamHI双酶切处理的pCBS-PComA载体，利用BglII和BamHI为同尾酶的原因，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆兆新，孙静，别小妹，吕凤霞，赵海珍，李金良，
申请(专利权)人：南京农业大学，南京福斯弗瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32