一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法和应用技术

本发明专利技术属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法和应用。本方法采用分子生物学技术，通过在地衣芽胞杆菌中敲除转录抑制因子基因ccpC，获得了ccpC缺失的地衣芽胞杆菌工程菌株WX‑02△ccpC，显著提高了地衣芽胞杆菌甘油代谢的速率。WX‑02△ccpC在不同培养基中的甘油消耗速率比原始菌地衣芽胞杆菌WX‑02至少提高了18.38%，最高可达32.67%。利用该菌株在聚γ‑谷氨酸发酵培养基中能够显著提高聚γ‑谷氨酸的产量，至少提高了10.7%，最高可达17.4%。说明该基因工程改造方法在提高微生物甘油代谢速率具有重要作用，并提高甘油合成生物基化学品的效率。

【技术实现步骤摘要】
一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法和应用
本专利技术属于基因工程和微生物
，具体涉及一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法和应用。
技术介绍
甘油是生物柴油生产加工的主要副产物，每生产10吨生物柴油产生约1吨粗甘油，目前生物柴油加工业产生大量的粗甘油，产生使得粗甘油价格巨低，造成粗甘油滞销，降低了生物柴油企业利润。因此，甘油作为发酵的碳源具有更多的还原力，相同质量的甘油和葡萄糖，甘油能够产生更多的生物化合物。目前已有诸多报道利用甘油为碳源发酵合成各种生物基化学品，例如，乙醇，乳酸，琥珀酸，柠檬酸，PHA，聚γ-谷氨酸等。然而目前通过微生物转化甘油合成生物基化学品，普遍存在菌株在甘油为碳源的培养基中生长缓慢，甘油代谢速率慢，导致发酵产物的合成效率低，产率低，增加了发酵的成本和周期。提高微生物的甘油代谢速率是解决甘油作为碳源工业化生产生物基化学品的关键。目前对甘油利用的研究主要集中在强化甘油代谢的途径和发酵产物合成途径方面，对转录因子对甘油代谢的影响报道较少。转录抑制因子CcpC在菌体的碳代谢中具有重要作用，但人们目前对此研究报道较少。之前的研究中，CcpC能够调节TCA循环基因的表达，从而调节碳代谢流的分布。甘油属于非PTS转运的碳源，到目前为止，转录抑制因子CcpC与甘油代谢之间关系的未见报道，因此CcpC的表达水平是否会影响甘油的代谢并不清楚，目前报道很多芽胞杆菌，包括枯草芽胞杆菌，地衣芽胞杆菌，解淀粉芽胞杆菌均能够代谢甘油，然而这些菌株甘油代谢的速率比较慢，需要进一步提高甘油的代谢能力，加快甘油的转化水平，从而实现利用廉价粗甘油高效合成有价值的化学物。本研究以地衣芽胞杆菌为例，研究发现通过在地衣芽胞杆菌中通过敲除ccpC能够显著提高甘油利用速率。本研究表明敲除转录抑制因子ccpC在芽胞杆菌高效利用甘油合成生物基化学品方面具有重要的科研意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法，通过敲除地衣芽胞杆菌中ccpC，能够显著提高地衣芽胞杆菌的甘油利用速率。本专利技术的另一个目的在于提供了一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法的应用。利用本专利技术的方法，可用于工业化制备聚γ-谷氨酸。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法，利用本领域的常规手段敲除地衣芽胞杆菌中ccpC。以上所述的方法中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)为地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02；以上所述的方法中，具体的，包括下述步骤：(1)根据地衣芽胞杆菌WX-02中调控因子基因ccpC序列，采用PCR的方法扩增出ccpC上下游同源臂序列A和B；并通过SOE的方法将A和B连到一起，构成A+B，随后用Xba1和BamHI双酶切A+B片段，并与经相同内切酶酶切后的T2(2)-ori质粒连接，转化DH5α，对阳性转化子克隆抽质粒进行双酶切和测序验证，最终得到ccpC的敲除载体T2(2)-ccpC。(2)将T2(2)-ccpC电转化至地衣芽胞杆菌WX-02中，对阳性转化子进行菌落PCR验证和抽质粒验证；将阳性转化子转接培养数次后，得到ccpC基因的上游同源臂或ccpC基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；挑选ccpC基因的同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选双交换菌株，对于阳性克隆进行PCR验证并进行测序，得到ccpC基因敲除的地衣芽胞杆菌WX-02ΔccpC。所述的ccpC基因序列为SEQIDNO.1所示。一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法的应用，包括利用本领域的常规方式，将获得的地衣芽孢杆菌进行工业发酵以生产聚γ-谷氨酸；或是用于制备高效代谢甘油的芽胞杆菌。以上所述的应用中，优选的，所述发酵的培养基配方，包括：60-100g/L甘油，8-16g/L柠檬酸钠，5-15g/LNaNO3，20-40g/L谷氨酸钠。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：转录抑制因子CcpC是芽胞杆菌中一种重要的碳代谢转录因子，本研究通过缺失ccpC，显著提高了地衣芽胞杆菌利用甘油的代谢速率。该研究结果表明缺失转录抑制因子基因ccpC是一种十分有效的提高微生物利用甘油速率的方法，利用本专利技术提供的方法获得的地衣芽胞杆菌WX-02ΔccpC株，在不同培养基中的甘油消耗速率比原始菌地衣芽胞杆菌WX-02至少提高了18.38％，最高可达32.67％。利用该菌株在聚γ-谷氨酸发酵培养基中能够显著提高聚γ-谷氨酸的产量，至少提高了10.7％，最高可达17.4％本研究为微生物高效利用甘油合成生物基化学品提供了一种新策略。附图说明图1为实施例1中PCR扩增转录抑制因子基因ccpC上下游同源臂泳道1：基因ccpC上游同源臂；泳道2为5KDNAmarker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道3：基因ccpC下游同源臂。图2为实施例2中ccpC敲除菌株的构建示意图；泳道1和2：ccpC缺失菌株的菌落PCR验证；泳道3-5野生型菌株的PCR验证：泳道6：5KDNAmarker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。具体实施方式结合以下实例，对本专利技术进行进一步说明，本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：地衣芽胞杆菌ccpC敲除载体的构建步骤1：根据地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA序列中的ccpC基因(SEQIDNO.1所示)的上、下游序列，设计ccpC基因的上游同源臂引物(A-F和A-R)、下游同源臂引物(B-F和B-R)；并以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，分别以ccpC基因的上游同源臂引物、下游同源臂引物进行PCR扩增得到ccpC基因的上游同源臂(833bp)和ccpC基因的下游同源臂(885bp)；其中，A-F、A-R、B-F、B-R的序列为：A-F：GCTCTAGAAAATGTGGATAGCCTGAC、A-R：GAGTCCTGCCTTTCTAGTGTGGACATTCCTCATTCCAATAAGT、B-F：ACTTATTGGAATGAGGAATGTCCACACTAGAAAGGCAGGACTC、B-R：TGCGAGCTCCAAAGCCGTCCGTTCTCC；步骤2：通过重叠延伸PCR将ccpC基因的上游同源臂和ccpC基因的下游同源臂连接到一起(所用引物为A-F和B-R)，构成目的基因片段(1718bp)；步骤3：采用BamHI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段和T2(2)-ori质粒进行双酶切得到酶切基因片段(1718bp),其中，所述的限制性内切酶BamHI和XbaI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；将步骤(3)得到的酶切基因片段和线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到连接本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法，利用本领域的常规手段敲除地衣芽胞杆菌中ccpC。

【技术特征摘要】
1.一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法，利用本领域的常规手段敲除地衣芽胞杆菌中ccpC。2.根据权利要求1所述的方法，所述的地衣芽胞杆菌（Bacilluslicheniformis）为地衣芽胞杆菌（Bacilluslicheniformis）WX-02。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：（1）根据地衣芽胞杆菌WX-02中调控因子基因ccpC序列，采用PCR的方法扩增出ccpC上下游同源臂序列A和B；并通过SOE的方法将A和B连到一起，构成A+B，随后用Xba1和BamHI双酶切A+B片段，并与经相同内切酶酶切后的T2(2)-ori质粒连接，转化DH5α，对阳性转化子克隆抽质粒进行双酶切和测序验证，最终得到ccpC的敲除载体T2(2)-ccpC；（2）将T2(2)-ccpC电转化至地衣芽胞杆菌WX-02中，对阳性转化...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，占杨杨，王欢，周梦林，许勇，石姣，马昕，李鑫，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42