一种编辑猪属胎儿成纤维细胞中的BMPR-IB基因方法技术

本申请提供了一种编辑猪属(Sus)胎儿成纤维细胞中的BMPR‑IB基因方法，其包括如下步骤：1)建立待编辑的猪属胎儿成纤维细胞；2)确定待编辑的猪属BMPR‑IB基因中与羊的BMPR‑IB基因746GG相应的位点为746AA；3)利用CRISPR/Cas系统将所述BMPR‑IB基因第746位的碱基AA编辑为碱基AG或GG。

A method for editing BMPR-IB gene in porcine fetal fibroblasts

The present application provides a BMPR IB gene method in the edited Sus fetal fibroblasts, which includes the following steps: 1) establish the porcine fetal fibroblasts to be edited; 2) determine that the loci of the BMPR 746GG of the porcine IB gene to be edited are 746AA; 3) use the CRISPR/Cas system to make the B. The base AA of MPR 746th IB gene is base AG or GG.

【技术实现步骤摘要】
一种编辑猪属胎儿成纤维细胞中的BMPR-IB基因方法
本申请提供了一种编辑猪属胎儿成纤维细胞中的BMPR-IB基因方法，特别是涉及利用CRISPR/Cas9系统对猪属胎儿成纤维细胞中的BMPR-IB基因第746位的碱基A编辑为碱基G的方法。
技术介绍
我国是世界最大的猪肉生产国和消费国，2015年，猪肉产量5671.39万吨，占全国肉类总产量的65％左右。产仔性状是养猪生产中的重要经济性状，我国现有能繁母猪4300万头，如果每头母猪平均每胎多产仔1头，则全国每年可增产近9000万头商品猪。但产仔性状的选育改良很难，丹麦花了近50年的时间才将长白猪的窝产仔数量提高了1头。BMPR-IB基因被证明是导致BooroolaMerino羊的多胎性能的主效基因，其编码区A746G位点(SEQIDNo.1的第902bp处，BMPR-IB基因CDS序列为157至1665位))的G为有利等位基因，对排卵数呈加性效应。研究表明，每一个BMPR-IB有利等位基因(G)平均增加排卵数1.5～1.65个，增加产羔数0.9～1.2个；两个拷贝(GG)平均增加排卵数2.7～3.0个，增加产羔数1.1～1.7个。在表型上有利突变型BooroolaMerino母羊(BB)平均排卵4.65个，显著高于对照组排卵数1.62个。现有的报道表明，A746G的G有利等位基因仅在绵羊和山羊中发现，在猪等其它哺乳动物中未发现存在G有利等位基因。猪与绵羊的BMPR-IB基因cDNA序列的同源性仅达到86％。基因组编辑是指利用特异性的核酸酶，通过同源介导修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)修复机制以实现外源DNA的插入、删除或替换，从而在基因组水平对基因及其调控元件进行定向修饰的一种基因工程手段。迄今为止，成功应用于基因组编辑的特异性核酸酶包括ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活子样效应因子核酸酶)和CRISPR/Cas(成簇规律间隔短回文重复序列)。最近几年呈现出爆发式发展的CRISPR/Cas9技术因其相比ZFN和TALEN更方便、快捷、高效和低成本。CRISPR/Cas是一种后天性免疫系统，在约40％细菌、几乎所有的古细菌和少量噬菌体中均存在。根据CRISPR基因座和Cas基因的不同，CRISPR/Cas体系目前被分成I、II和III型，作为II型的CRISPR/Cas9是三类体系中结构较简单的一种。CRISPR/Cas9基因组编辑基本原理是：靶位点特异性crRNA和辅助的tracrRNA形成gRNA(嵌合向导RNA)，指引Cas9蛋白切割目标区域的DNA序列，目标区域为PAM(原型间隔序列毗邻基序)前的gRNA识别序列，其中Cas9的HNH结构域切割与crRNA互补配对的模板链，Cas9的RuvC结构域切割含有PAM的链。人工改造的CRISPR/Cas9系统将tracrRNA和crRNA双组分利用基因工程整合为一条链，称为sgRNA(单链引导RNA)；将人工设计的针对某个目的基因的sgRNA序列连接在CRISPR/Cas9质粒上，即可针对该基因开展基因组编辑工作。
技术实现思路
本申请提供了一种编辑猪属(Sus)胎儿成纤维细胞中的BMPR-IB基因方法，其包括如下步骤：1)建立待编辑的猪属(Sus)胎儿成纤维细胞；2)确定待编辑的猪属BMPR-IB基因中与羊的BMPR-IB基因746GG相应的位点为746AA；3)利用CRISPR/Cas系统将所述猪属BMPR-IB基因第746位的碱基AA编辑为碱基AG或GG。在一个具体实施方式中，在步骤3)中，所述CRISPR/Cas系统为CRISPR/Cas9系统，连接sgRNA之前的质粒载体为PX458。在一个具体实施方式中，在步骤3)中，在待编辑的猪属胎儿成纤维细胞的染色体DNA序列中确定CRISPR/Cas9系统中使用的PAM序列，将位于所述PAM序列上游的17至22个碱基确定为编辑BMPR-IB基因第746位碱基的sgRNA，将所述sgRNA连接到所述PX458上，得到PX458-BMPR-IB-746G；优选所述PAM序列为SEQIDNo.2中第1206位至第1208位的GGG；更优选地，所述sgRNA的序列如SEQIDNo.3所示。在一个具体实施方式中，在步骤3)中，所述sgRNA连接到所述PX458上的过程如下：3-1-I)利用BbsI限制性内切酶对PX458进行线性化，得到线性化的PX458质粒；3-1-II)设计所述sgRNA的正向引物和反向引物；所述正向引物中含有能够与所述线性化的PX458质粒的粘性末端互补的BbsI限制性内切酶酶切位点的粘性末端CACC，所述反向引物中含有能够与所述线性化的PX458质粒的粘性末端互补的BbsI限制性内切酶酶切位点的粘性末端AAAC；将所述正向引物和反向引物退火成双链，得到sgRNA双链片段；3-1-III)在含有连接酶的体系中将线性化的PX458质粒与sgRNA双链片段进行连接，得到连接产物；3-1-IV)将所述连接产物转化到感受态大肠杆菌中，筛选出阳性连接产物PX458-BMPR-IB-746G。在一个具体实施方式中，在步骤3)中，确定与所述PX458-BMPR-IB-746G配合的供体DNA的序列；在所述供体DNA的序列中包含BMPR-IB基因的746G以及sgRNA序列，并且sgRNA序列下游的3个碱基不能为PAM序列，所述供体DNA的其他序列与待编辑的猪属胎儿成纤维细胞的染色体DNA序列一致；优选所述供体DNA的序列具有300bp至3kb的长度；更优选供体DNA的序列具有500bp至1000bp的长度；最优选所述供体DNA的序列如SEQIDNo.20所示，其中与所述染色体DNA中的所述PAM序列对应的序列为GGC。在一个具体实施方式中，在步骤3)中，将所述PX458-BMPR-IB-746G和所述供体DNA序列转染到所述猪属胎儿成纤维细胞中并筛选BMPR-IB基因的746AA突变为AG杂合子或GG纯合子的阳性克隆，过程如下：3-2-I)将0(也可以称之为原代)至3代的所述猪属胎儿成纤维细胞进行培养，培养液为包括青霉素(其用量可以为0.9wt％至1.2wt％)、链霉素(其用量可以为0.9wt％至1.2wt％)，以及体积含量18％-22％胎牛血清的高糖DMEM(Gibco公司，货号：11995-065)；待细胞汇合度达90％以上时，将PX458-BMPR-IB-746G、供体DNA、PX459v2以及DNA连接酶IV抑制剂SCR7混合，并转染猪胎儿成纤维细胞；3-2-II)利用PCR测序法筛选阳性克隆。在一个具体实施方式中，转染猪胎儿成纤维细胞所用的所述PX458-BMPR-IB-746G、供体DNA和PX459v2的质量比为(1.8-2.2)：(1.8-2.2)：1；优选转染400-600万个猪胎儿成纤维细胞所用的所述PX458-BMPR-IB-746G、供体DNA和PX459v2的用量依次为25μg、25μg和12.5μg。在一个具体实施方式中，建立猪属胎儿成纤维细胞的过程如下：1-I)从怀孕25-35天的猪属动物中分离出单个带有胎膜的胎儿，置于含青霉素(其用量可以为4.5wt％至5.5wt％)和链霉素(其用量可以为4.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编辑猪属(Sus)胎儿成纤维细胞中的BMPR‑IB基因方法，其包括如下步骤：1)建立待编辑的猪属胎儿成纤维细胞；2)确定待编辑的猪属BMPR‑IB基因中与羊的BMPR‑IB基因746GG相应的位点为746AA；3)利用CRISPR/Cas系统将所述猪属BMPR‑IB基因第746位的碱基AA编辑为碱基AG或GG。

【技术特征摘要】
1.一种编辑猪属(Sus)胎儿成纤维细胞中的BMPR-IB基因方法，其包括如下步骤：1)建立待编辑的猪属胎儿成纤维细胞；2)确定待编辑的猪属BMPR-IB基因中与羊的BMPR-IB基因746GG相应的位点为746AA；3)利用CRISPR/Cas系统将所述猪属BMPR-IB基因第746位的碱基AA编辑为碱基AG或GG。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述CRISPR/Cas系统为CRISPR/Cas9系统，连接sgRNA之前的质粒载体为PX458。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，在待编辑的猪属胎儿成纤维细胞的染色体DNA序列中确定CRISPR/Cas9系统中使用的PAM序列，将位于所述PAM序列上游的17至22个碱基确定为编辑BMPR-IB基因第746位碱基的sgRNA，将所述sgRNA连接到所述PX458上，得到PX458-BMPR-IB-746G；优选所述PAM序列为SEQIDNo.2中第1206位至第1208位的GGG；更优选地，所述sgRNA的序列如SEQIDNo.3所示。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述sgRNA连接到所述PX458上的过程如下：3-1-I)利用BbsI限制性内切酶对PX458进行线性化，得到线性化的PX458质粒；3-1-II)设计所述sgRNA的正向引物和反向引物；所述正向引物中含有能够与所述线性化的PX458质粒的粘性末端互补的BbsI限制性内切酶酶切位点的粘性末端CACC，所述反向引物中含有能够与所述线性化的PX458质粒的粘性末端互补的BbsI限制性内切酶酶切位点的粘性末端AAAC；将所述正向引物和反向引物退火成双链，得到sgRNA双链片段；3-1-III)在含有连接酶的体系中将线性化的PX458质粒与sgRNA双链片段进行连接，得到连接产物；3-1-IV)将所述连接产物转化到感受态大肠杆菌中，筛选出阳性连接产物PX458-BMPR-IB-746G。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，确定与所述PX458-BMPR-IB-746G配合的供体DNA的序列；在所述供体DNA的序列中包含BMPR-IB基因的746G以及sgRNA序列，并且sgRNA序列下游的3个碱基不能为PAM序列，所述供体DNA的其他序列与待编辑的猪属胎儿成纤维...

【专利技术属性】
技术研发人员：幸宇云，任军，杨强，乔传民，黄路生，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：江西,36