一种分离的基因序列在制备日本青鳉白化品系中的应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种分离的基因序列在制备日本青鳉白化品系中的应用，所述的基因序列为SEQ ID NO.1所示。以SEQ ID NO.1为靶基因进行基因突变，挑选出色素缺失明显的F0的胚胎培养成亲本鱼，通过F0突变体亲本杂交产生F1胚胎，筛选出色素缺失的F1胚胎继续培养，能产生眼部表现为红色的稳定遗传的青鳉白化品系。利用基因突变的方法获得青鳉白化品系比传统方式具有突变率高（超过90%突变率）、育种时间短（2‑3天后可以观察到突变表型以便后续筛选）、成本低等优点，具有科学研究的基础价值和应用价值。

Application of a separate gene sequence in preparation of albino strain of Japanese green

The present invention belongs to the field of molecular biology, in particular to the application of a separate gene sequence in the preparation of the Japanese green whitening line. The gene sequence is shown by SEQ ID NO.1. The gene mutation was carried out with the target gene of SEQ ID NO.1 as the target gene, and a parent fish was cultured with the F0 of the missing pigment. The F1 embryo was produced by the parent hybridization of the F0 mutant, and the F1 embryo with the missing pigment was screened to continue to be cultured. Using the method of gene mutation, it has the advantages of high mutation rate (more than 90% mutation rate), short breeding time (2 after 3 days of mutation) and low cost, which has the basic value and application value of scientific research.

【技术实现步骤摘要】
一种分离的基因序列在制备日本青鳉白化品系中的应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种分离的基因序列在制备日本青鳉白化品系中的应用，以本专利技术提供的序列为靶序列，可通过表型筛选快速且高效的获得可稳定遗传的日本青鳉白化突变体。
技术介绍
青鳉(Oryziaslatipes)具有品系多，体型小、饲养方便、繁殖力强、繁殖周期短、性别差异明显，性别决定基因已知，胚胎透明和胚胎发育速度快等优点，是研究发育生物学、环境毒理学、细胞生物学和免疫学等诸多领域的重要模式生物(Furutani-Seiki&Wittbrodt,2004)。青鳉的基因组和转录组等数据完善(K.P.Laietal.,2015)，胚胎干细胞、生殖干细胞、单倍体干细胞等都已建立(Hongetal.,2004)。青鳉产卵量大且易于收集，胚胎成活率高，DNA显微注射和细胞移植方便等，研究者们已成功得到了半克隆动物(Yi,Hong,&Hong,2009)，实现了基因敲降(Paul-Prasanthetal.,2006)和基因敲除(Ansai&Kinoshita,2014)。在鱼类中关于白化现象的研究较少，主要集中在自然突变的青鳉(Iidaetal.,2005)、斑马鱼(Daniorerio)(Jin&Thibaudeau,1999)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)(Estevez&Kanazawa,1995)等。典型的青鳉白化表型为皮肤色素减少甚至无色素，眼睛表型为红色(Koga,Inagaki,Bessho,&Hori,1995)。目前，已报道的自然突变类型有i1、i2、i3、i4、i6、ib等(Hyodo-Taguchi,Winkler,Kurihara,Schartl,&Schartl,1997；Iidaetal.,2004)。tyr-i1品系第一个外显子插入了1.9kb的DNA片段。tyr-i4的形成是由于在第5个外显子上插入了4.7kb的大片段形成的。进过序列比对分析tyr-i6品系有三个地方碱基缺失，分别是8bp，44bp，245bp。前两个缺失片段位于内含子中，最后一个位于第二个内含子和第三个外显子中。tyr-ib白化品系是由于在tyr基因启动子区域插入了tol2转座子结构造成的。目前，青鳉白化品系都是通过人工筛选自然突变获得的纯系，这些突变体的形成具有极大的随机性，突变频率非常低。其白化表型与其序列突变之间的关系依然有待研究。ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas9)是2013年初出现的新一代基因编辑技术。它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统人工改造而成，具有制作简单、使用方便、成本低、作用效率高等特点(Mussolino&Cathomen,2013)。2013年初MIT华裔科学家张锋研究团队首次报道利用CRISPR/Cas9系统对人293T细胞和小鼠Nero2A细胞实现基因定点突变(Congetal.,2013)。同一期的《科学》杂志也发表了Mail等利用CRISPR/Cas9系统用于人类细胞基因组研究(Malietal.,2013)。相对于第一、二代基因编辑技术，第三代CRISPR/Cas9基因编辑技术独特的优势迅速吸引了人们的关注，掀起了CRISPR/Cas9基因编辑技术研究热潮，并于2013被《科学》杂志评为年度十大科学进展之一。目前，CRISPR/Cas9技术被广泛应用于人(Homosapiens)(Liangetal.,2015)、猴子(Macacafascicularis)(Kangetal.,2015)、猪(Susscrofadomestica)(S.Laietal.,2016)小鼠(Musmusculus)(Coppolaetal.,2015)、果蝇(Drosophilamelanogaster)(Port&Bullock,2016)、斑马鱼(Xieetal.,2016)等。目前，使用最广泛的CRISPR/Cas9系统是来自S.pyogenes细菌的Cas9基因以及人工改造而成的sgRNA(SingleguideRNA)体系。Cas9是一种人工核酸内切酶，能与sgRNA结合，在sgRNA的引导下识别PAM(protospaceradjacentmotif，PAM)序列，并对特定部位进行切割产生DNA双链断裂(Congetal.,2013)。DNA双链断裂后在无修复模板的情况下可利用非同源末端连接机制实现靶基因敲除；在有修复模板的情况下可利用同源重组或微同源末端连接机制实现定点基因敲入。CRISPR/Cas9系统的编辑效率取决于sgRNA和Cas9。sgRNA可以通过在线网站设计，选取脱靶位点少、评分高的靶点。Cas9mRNA需要翻译成Cas9蛋白质才能在sgRNA的引导下对DNA进行切割，而在翻译过程中不同物种具有密码子偏好。因此，Cas9基因需要根据相应物种进行密码子优化，才能达到最佳编辑效果。目前，在鱼类中使用最广泛的Cas9基因是经过斑马鱼密码子优化的zCas9基因(FenghuaZhangetal.,2016)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于一种分离的基因序列在制备日本青鳉白化品系中的应用，所述序列为SEQIDNO.1所示。以该序列为靶序列，进行基因突变，可快速获得白化的日本青鳉，方法易行，操作简单。本专利技术的另一个目的在于提供了一种日本青鳉白化品系的突变基因序列，所述的基因序列为SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：SEQIDNO.1所示序列在制备日本青鳉白化品系中的应用，利用本领域的常规方式，以SEQIDNO.1为靶基因进行基因突变，挑选出色素缺失明显的F0的胚胎培养成鱼亲本，通过F0突变体亲本杂交产生F1胚胎，筛选出色素缺失的F1胚胎继续培养，眼部表现为红色的即为稳定遗传的日本青鳉白化品系。以上所述的应用中，优选的，采取CRISPR/Cas9的方式，以SEQIDNO.1所示序列为靶位点进行基因编辑。以上所述的应用中，优选的，在白化品系中，包含SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的基因序列。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术的方法可用于快速建立青鳉白化品系。该方法易行，操作简单，不需要进行大量的PCR筛选，可以直接通过表型观测，快速且高效的获得白化品系。利用基因突变的方法获得青鳉白化品系比传统方式具有突变率高(超过90％突变率)、育种时间短(2-3天后可以观察到突变表型以便后续筛选)、成本低等优点，具有科学研究的基础价值和应用价值。该方法可以成为一种快速获得青鳉白化品系的新技术，并可用于动物白化病致病机理研究，还为其建立观赏鱼类或者其他鱼类基因突变获得稳定品系提供方法。附图说明图1为青鳉tyr基因的突变设计和靶位点的序列分析示意图；确定靶位获得了序列的突变而导致了白化。图2为野生青鳉的胚胎和幼鱼。图3为tyr突变杂合子的青鳉胚胎和幼鱼。图4为tyr突变纯合子的青鳉胚胎和幼鱼。图5为野生青鳉的成鱼。图6为使用CRISPR/Ca本文档来自技高网...

【技术保护点】
SEQ ID NO.1所示序列在制备日本青鳉白化品系中的应用。

【技术特征摘要】
1.SEQIDNO.1所示序列在制备日本青鳉白化品系中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其应用过程包括：以SEQIDNO.1为靶基因进行基因突变，挑选出色素缺失明显的F0的胚胎培养成鱼亲本，通过F0突变体亲本杂交产生F1胚胎，筛选出色素缺失的F1胚胎继...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈天圣，方健，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42