获得无缝修饰的纯合突变的方法技术

一种获得无缝修饰的纯合突变的方法，包括：(1)用基因编辑系统对细胞基因组中需要突变的位点进行切割产生双链断裂；(2)将含有目的突变序列和不同抗性的两种转座子通过同源重组分别整合进入细胞基因组的一对等位基因中；(3)筛选等位基因都整合有转座子的细胞克隆，然后将转座子切除；(4)将残留有转座子的细胞克隆致死，获得含有无缝修饰的纯合突变的细胞克隆。所述方法可以显著提高获得纯合突变的概率，节约人力物力以及时间，并且适用范围广。

A method of obtaining homozygous mutagenesis of seamless modification

Including a seamless modification method of homozygous mutations: (1) gene editing system for cutting produce double strand breaks of mutant cells in the genome site; (2) with different resistance to mutations and two were integrated into the cell genome through homologous recombination transposon a pair gene; screening (3) alleles were integrated with cell cloning transposon, and transposon excision; (4) the residual cell clone transposon lethal, with seamless modified homozygous mutant clones. The method can significantly improve the probability of obtaining homozygous mutation, save manpower and material resources and time, and have a wide range of application.

【技术实现步骤摘要】
获得无缝修饰的纯合突变的方法
本专利技术属于分子生物学领域，尤其涉及一种获得无缝修饰的纯合突变的方法。
技术介绍
与动物模型相比，基于人iPS衍生的细胞模型具有一系列的优势，如可以纯化为某一特定的细胞类型并进行研究，方便高通量筛选化合物和基因靶点，可以获得多种基因突变细胞并以此研究细胞表型和致病机理，与人没有物种上的差异。病人身上的细胞经过重程序设计获得iPS，可以研究很多种遗传性疾病。当然，病人细胞的获得，致病突变基因的确认，不同基因背景细胞的共同分析都对遗传性疾病的研究造成障碍。但这些障碍，可以通过在正常iPS细胞引入与疾病相关的基因突变，获得一系列相同基因背景的iPS细胞获得解决。在正常iPS细胞精确而无缝地引入疾病相关突变，目前最常用的方法是CRISPR/Cas9结合单链DNA寡核苷酸(ssDONs)以及CRISPR/Cas9结合piggyBac转座子。当导向RNA(gRNA)通过Watson-Crick配对识别一段特异的DNA序列后，Cas9可以使双链产生断裂。双链断裂是同源重组获得基因突变所必须的，当然，这同样会刺激另外一种更常见的内源性DNA修复途径-非同源末端连接(NHEJ)，这将会对精确无缝的基因修饰造成障碍。合成ssODNs虽然可以便利地从公司订购，但是它缺少筛选系统，使得基因精确无缝修饰效率相当低。piggyBac转座子可能构建质粒会相对麻烦点，但是它可以携带筛选系统，获得目的无缝杂合突变会相对更容易些。当然，对于纯合突变来说，使用CRISPR/Cas9结合piggyBac的方法获取效率非常低，从而造成人力物力以及时间上的巨大浪费。因此，高效获得无缝修饰的纯合突变的方法对目前遗传性疾病的研究来说是非常必要的。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提出了一种获得无缝修饰的纯合突变的方法，可以显著提高纯合突变的获取效率。一方面，本专利技术提供了一种获得无缝修饰的纯合突变的方法，包括：(1)用基因编辑系统对细胞基因组中需要突变的位点进行切割产生双链断裂；(2)将含有目的突变序列和不同抗性的两种转座子通过同源重组分别整合进入细胞基因组的一对等位基因中；(3)筛选等位基因都整合有转座子的细胞克隆，然后将转座子切除；(4)将残留有转座子的细胞克隆致死，获得含有无缝修饰的纯合突变的细胞克隆。优选地，所述方法在诱导性多功能干细胞iPS中进行。优选地，所述基因编辑系统为CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN或者CRISPR/Cpf1。优选地，步骤(2)包括：用含有第一抗性和目的突变序列的转座子通过同源重组方式整合到基因组中，然后进行第一抗性筛选；用基因编辑系统对上述突变位点再次进行切割产生双链断裂；用含有第二抗性和目的突变序列的转座子通过同源重组方式整合到基因组中，然后进行第二抗性筛选。优选地，将第一抗性筛选和第二抗性筛选后的细胞进行扩增。优选地，所述第一抗性和第二抗性选自puro、hygR或NeoR中的两个。优选地，所述转座子为piggyBac转座子。优选地，步骤(3)中利用转座酶将转座子切除，步骤(4)中用FIAU将残留有转座子的细胞克隆致死。所述方法可以用于定点修复、定点突变、基因敲除或基因敲入。所述方法还可以用于建立疾病模型。相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术利用基因编辑系统结合携带不同抗性筛选的转座子获得纯合突变的概率显著上升，节约了人力物力以及时间；(2)本专利技术所述方法的适用范围广，适用于CRISPR/Cas9、ZFN(锌指核糖核酸酶)、TALEN(transcriptionactivator-like(TAL)effectornucleases)、CRISPR/Cpf1等所有基因编辑系统，双抗性的选择范围也比较广泛；(3)双抗性筛选结合不同的基因编辑体系，不仅适用于定点修复以及定点突变，还可以适用于对基因的敲出(Knockout)和敲入(knockin)；(4)通过本专利技术所述方法引入基因突变可以方便地建立疾病模型。附图说明图1A为实施例1中获得无缝杂合突变的流程图；图1B为实施例1中的piggyBac质粒以及PCR验证的示意图；图1C为实施例1中PSEN1的序列以及基因定点编辑后所得到的PSEN1F105C和PSEN1ΔI83M84序列；图1D为实施例1中puro基因片段的PCR检测结果；图1E为实施例1中在Scr7和NU7026作用下突变后基因的PCR检测结果；图2A为实施例2中获得无缝纯合突变的流程图；图2B为实施例2中的piggyBac质粒以及PCR验证的示意图；图2C为实施例2中经过puro和HygR抗性的筛选后初步筛选没有“WT”条带的细胞克隆；图2D为实施例2中puro和HygR基因片段的PCR检测结果；图2E为实施例2中PSEN1F105C和PSEN1ΔI83M84基因突变的各iPS细胞系的测序鉴定结果；图3为实施例3中携带PSEN1F105C和PSEN1ΔI83M84基因编辑的细胞获得基因突变依赖性的疾病相关表型变化情况：其中A为PSEN1F105C和PSEN1ΔI83M84iPS细胞衍生的神经元在APP表达水平上呈基因突变依赖性变化；B为PSEN1F105CiPS细胞和神经元在Aβ42∶40比值上呈基因突变依赖性变化；C为PSEN1ΔI83M84iPS细胞和神经元在Aβ42∶40比值上呈基因突变依赖性变化，**P＜0.05and***P＜0.001，one-wayANOVA。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术作进一步的详细说明。在本专利技术的实施例中，为了获得精确无缝的纯合突变，CRISPR/Cas9结合携带两个分别含有puro/TK抗性筛选以及hygR/TK的piggyBac转座子，Cas9在特定序列切割后，含有puro/TK抗性的piggyBac转座子通过同源重组方式先整合到基因组中，用嘌呤霉素作用3-5天后，剩余的细胞扩增后再次转染CRISPR/Cas9以及含有hygR/TK的piggyBac转座子，经过hygR抗性筛选3-5天后，铺单细胞克隆，选择等位基因都整合piggyBac转座子的克隆，利用转座酶将piggyBac转座子切除，再使用FIAU使残留有piggyBac转座子的细胞克隆致死，从而得到含有纯合突变的无缝修饰克隆。其中用于富集作用的双抗性的使用不仅仅限于puro，hygR或NeoR的两两组合。在下面的实施例中，以正常iPS细胞为例，利用CRISPR/Cas9结合piggyBac转座子引入家族性阿尔茨海默病(AD)相关突变PSEN1F105C以及PSEN1ΔI83M84，并将他们分化为神经元，其疾病表型获得了基因突变依赖性的变化。实施例1CRISPR/Cas9结合携带有puro/TK抗性筛选的piggyBac转座子高效获得杂合突变实验方法1、细胞培养和转染把iPS细胞种在预包被Matrigel(BDBiosciences)的细胞培养板上，并用mTeSRTM1(StemcellTechnologies)于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。Lipofectamine转染前，把iPS细胞按每孔4×105～5×105密度传代于包被Matrigel的六孔板上，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得无缝修饰的纯合突变的方法，包括以下步骤：(1)用基因编辑系统对细胞基因组中需要突变的位点进行切割产生双链断裂；(2)将含有目的突变序列和不同抗性的两种转座子通过同源重组分别整合进入细胞基因组的一对等位基因中；(3)筛选等位基因都整合有转座子的细胞克隆，然后将转座子切除；(4)将残留有转座子的细胞克隆致死，获得含有无缝修饰的纯合突变的细胞克隆。

【技术特征摘要】
1.一种获得无缝修饰的纯合突变的方法，包括以下步骤：(1)用基因编辑系统对细胞基因组中需要突变的位点进行切割产生双链断裂；(2)将含有目的突变序列和不同抗性的两种转座子通过同源重组分别整合进入细胞基因组的一对等位基因中；(3)筛选等位基因都整合有转座子的细胞克隆，然后将转座子切除；(4)将残留有转座子的细胞克隆致死，获得含有无缝修饰的纯合突变的细胞克隆。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法在诱导性多功能干细胞iPS中进行。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基因编辑系统为CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN或者CRISPR/Cpf1。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)包括：用含有第一抗性和目的突变序列的转座子通过同源重组方式整合到基因组中，然后进行第一抗性...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏焕兴，谭渊，黄志健，
申请(专利权)人：澳门大学，
类型：发明
国别省市：中国澳门,82