一种评价EML4‑ALK抑制剂对肺癌治疗效果的方法技术

本发明专利技术公开了一种评价药物对EML4‑ALK L1196M癌基因驱动的肺癌治疗效果的方法，该方法是在体外构建5’mROSA‑CAG‑lox‑stop‑lox‑EML4‑ALK L1196M‑3’mROSA基因片段，然后将该基因片段与cas9酶和gRNA共同注射到小鼠的胚胎中，小鼠出生后鉴定含有同源重组基因的小鼠，待小鼠发育至成年，激活EML4‑ALK L1196M癌基因，就会诱发肺癌的原位瘤，然后对小鼠给药治疗，评价治疗效果。本发明专利技术的评价方法能真实地模拟肺癌的临床过程，利用本发明专利技术的小鼠模型能准确地预测一个药物在肺癌临床中的表现：准确评价药物的急性毒性、慢性毒性、药代动力学、对肺癌的治疗效果。

An evaluation method of EML4 ALK inhibitor on lung cancer treatment

The invention discloses a method for lung cancer treatment effect evaluation of a drug to the EML4 driver ALK L1196M cancer gene, the method is to construct the 5 'mROSA CAG LOX stop LOX EML4 ALK L1196M 3 mROSA gene fragments in vitro, then the gene fragment and cas9 enzyme and gRNA co injection into mouse embryos in mice after birth with identification of homologous recombination gene in mice, the mice developed to adulthood, the activation of EML4 ALK L1196M oncogene, tumor in situ can cause lung cancer, then administered to the mice treatment, treatment effect evaluation. The clinical course of the assessment method of the invention can simulate lung cancer, using a mouse model of the invention can accurately predict the performance of a drug in lung cancer: the accurate evaluation of the effect of the treatment of acute toxicity, chronic toxicity and drug pharmacokinetics, for lung cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种评价EML4-ALK抑制剂对肺癌治疗效果的方法
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种评价药物对EML4-ALKL1196M癌基因驱动的肺癌治疗效果的方法。
技术介绍
肺癌是全球范围内发病率和致死率最高的癌症。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌按病理类型又分为腺癌、鳞癌和大细胞癌。肺癌的常规治疗方法是化疗，但化疗的疗效有限，并有较大的副作用。近年来，靶向治疗方法在肺癌治疗中展示出了良好的临床表现。靶向治疗的理论基础是：肺癌细胞的生存依赖于一个特定蛋白持续地执行功能，而非肺癌组织细胞则不依赖；用该蛋白的抑制剂治疗病人，能造成肺癌细胞的死亡，而其他细胞则不受影响。因此，靶向治疗具有高效性、低副作用的特点。EML4-ALK融合癌基因在约5％的中国肺癌病人中呈阳性。临床上用EML4-ALK的抑制剂(如克唑替尼)能有效地治疗该基因阳性的肺癌。但这些病人的肺癌在短暂的消退之后又会复发。复发的一个重要原因是EML4-ALK融合基因本身发生了突变，造成药物不能再抑制EML4-ALK的激酶活力。L1196M是临床上常见的抗克唑替尼药物的EML4-ALK的突变。开发抗L1196M突变的EML4-ALK的药物是目前研究领域的一个热点，也有一些药物正在做临床试验或已获批应用于临床。目前，评价L1196M突变的EML4-ALK的抑制剂治疗肺癌的方法大概可以分为两类：细胞模型和移植瘤模型。现在有一些肺癌细胞或人工转化而成的细胞，其存活依赖于EML4-ALKL1196M突变体的持续功能。用抑制剂封闭该癌蛋白的功能就会引起细胞凋亡。测定凋亡严重性可以反映该抑制剂治疗肺癌的能力。这种直接在细胞上测定药物治疗EML4-ALKL1196M效果的方法，有其固有的缺点：不能反映该药物在活体上的表现，如急性毒性，慢性毒性，药代动力学等。另一种方法是将上述细胞移植到免疫缺陷的小鼠上，待小鼠长出移植瘤后，用药物治疗小鼠，测量肿瘤的体积变化来推断药物的治疗效果。该模型的缺点是：接种的移植瘤不能真实模拟肺癌发生的微环境，同时免疫系统在肿瘤治疗过程中起着重要的作用。因此，用免疫缺陷的移植瘤来评价药物治疗肺癌的能力有比较高的几率出现误判：即药物在移植瘤模型上有效，而临床上没有效。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种评价药物对EML4-ALKL1196M癌基因驱动的肺癌治疗效果的方法，该方法的关键是在体外构建5’mROSA-CAG-lox-stop-lox-EML4-ALKL1196M-3’mROSA基因片段，然后将该基因片段与cas9酶和sgRNA共同注射到小鼠的胚胎中，小鼠出生后鉴定含有同源重组基因的小鼠，待小鼠发育至成年，激活EML4-ALKL1196M癌基因，就会诱发肺癌的原位瘤，然后对小鼠给药治疗，评价治疗效果。本专利技术的评价方法能最大限度地模拟病人体内肿瘤微环境，是一种更为科学和客观的评价方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种评价药物对EML4-ALKL1196M癌基因驱动的肺癌治疗效果的方法，包括以下步骤：(1)利用PCR方法扩增EML4-ALKL1196M基因片段并在其5’端和3’端分别加上EcoRI和NotI酶切位点，将所得到的片段连接到pClatent质粒上，得到pClatent-EML4-ALKL1196M质粒；用PCR方法扩增小鼠ROSA26位点两段序列作为同源臂，分别通过EcoRV和PacI、EcoRV和AscI插入到pClatent-EML4-ALKL1196M质粒上，从而得到mRosa-lsl-EML4-ALKL1196M质粒；用EcoRV酶将质粒上的载体片段(2.7Kb)切掉，得到5’mROSA-CAG-lox-stop-lox-EML4-ALKL1196M-3’mROSA基因片段(9.5Kb)；步骤(1)所述的加上酶切位点的EML4-ALKL1196M基因片段的序列如SEQ.ID.NO.1所示；步骤(1)所述小鼠ROSA26位点两段序列分别如SEQ.ID.NO.9和SEQ.ID.NO.10所示；步骤(1)所述的5’-mROSA-CAG-lox-stop-lox-EML4-ALKL1196M-3’mROSA基因片段其序列如SEQ.ID.NO.11所示；(2)将Cas9mRNA片段、gRNA片段和可诱导表达EML4-ALKL1196M的转基因片段5’mROSA-CAG-lox-stop-lox-EML4-ALKL1196M-3’mROSA混合，通过显微注射将混合物注射到小鼠的胚胎中，cas9在gRNA的引导下切开ROSA26位点，通过同源重组将可诱导表达的基因片段插入基因组；步骤(2)所述的混合物中，Cas9mRNA片段的浓度优选80ng/μL；gRNA片段的浓度优选30ng/μL；转基因片段5’mROSA-CAG-lox-stop-lox-EML4-ALKL1196M-3’mROSA的浓度优选8ng/μL；步骤(2)所述的gRNA，其序列如SEQ.ID.NO.12所示；步骤(2)所述的注射，注射量优选15pL；(3)将步骤(2)得到的转基因胚胎移植入代孕鼠子宫，饲养并待小鼠出生，设计三对引物分别对5’插入位点、3’插入位点和EML4-ALKL1196M基因进行PCR鉴定，筛选全部阳性的转基因小鼠；步骤(3)所述的将转基因胚胎移植入代孕鼠子宫，是将假孕的代孕鼠麻醉后，从腹部开口，暴露出输卵管口，将转基因胚胎移植入代孕鼠子宫后，用伤口夹封闭皮肤；(4)转基因阳性的小鼠饲养至成年，把含有CRE重组蛋白酶基因的病毒从鼻腔滴入小鼠肺中，从而将肺上皮细胞中的EML4-ALKL1196M癌基因激活，20天后小鼠得肺腺癌；通过CT检测和病理切片证实肺癌组织的存在；步骤(4)所述的成年是6-8周龄；(5)对小鼠给药，给药结束，CT检测肺癌大小，与治疗前的大小进行比较；(6)治疗结束后，处死小鼠，制备小鼠肺组织的病理切片，读取病理切片上的肺癌病理变化；再与CT检测结果结合，判断药物治疗EML4-ALKL1196M驱动肺癌的能力。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：利用本专利技术的方法能最大程度地模拟药物治疗EML4-ALKL1196M驱动的肺癌病人，真实的模拟了肺癌从癌基因的产生，肺上皮细胞癌变，肺癌的形成，最后小鼠死于肺癌的临床过程。利用本专利技术的小鼠模型能准确地预测一个药物在肺癌临床中的表现：准确评价药物的急性毒性、慢性毒性、药代动力学、对肺癌的治疗效果。附图说明图1是EML4-ALKL1196M基因片段PCR产物的电泳图；其中，泳道1和2均为PCR产物。图2是EML4-ALKL1196M小鼠第一对引物PCR产物电泳图；其中，泳道11为PCR产物。图3是EML4-ALKL1196M小鼠第二对引物PCR产物电泳图；其中，泳道11为PCR产物。图4是EML4-ALKL1196M小鼠第三对引物PCR产物电泳图；其中，泳道11为PCR产物。图5是用PF-06463922治疗前后肺癌CT检测结果图；其中，A-治疗前的结果，B-治疗后的结果。图6是用Ceritinib治疗前后肺癌CT检测结果图；其中，A-治疗前的结果，B-治疗后的结果。图7是HKI溶液治疗前后肺癌CT检测结果图；其中，A-治疗前的结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种评价药物对EML4‑ALK L1196M癌基因驱动的肺癌治疗效果的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)利用PCR方法扩增EML4‑ALK L1196M基因片段并在其5’端和3’端分别加上EcoRI和NotI酶切位点，将所得到的片段连接到pClatent质粒上，得到pClatent‑EML4‑ALK L1196M质粒；用PCR方法扩增小鼠ROSA26位点两段序列作为同源臂，分别通过EcoRV和PacI、EcoRV和AscI插入到pClatent‑EML4‑ALK L1196M质粒上，从而得到mRosa‑lsl‑EML4‑ALK L1196M质粒；用EcoRV酶将质粒上的载体片段切掉，得到5’mROSA‑CAG‑lox‑stop‑lox‑EML4‑ALK L1196M‑3’mROSA基因片段；步骤(1)所述的加上酶切位点的EML4‑ALK L1196M基因片段的序列如SEQ.ID.NO.1所示；步骤(1)所述小鼠ROSA26位点两段序列分别如SEQ.ID.NO.9和SEQ.ID.NO.10所示；步骤(1)所述的5’‑mROSA‑CAG‑lox‑stop‑lox‑EML4‑ALK L1196M‑3’mROSA基因片段其序列如SEQ.ID.NO.11所示；(2)将Cas9mRNA片段、gRNA片段和可诱导表达EML4‑ALK L1196M的转基因片段5’mROSA‑CAG‑lox‑stop‑lox‑EML4‑ALK L1196M‑3’mROSA混合，通过显微注射将混合物注射到小鼠的胚胎中，cas9在gRNA的引导下切开ROSA26位点，通过同源重组将可诱导表达的基因片段插入基因组；步骤(2)所述的gRNA，其序列如SEQ.ID.NO.12所示；(3)将步骤(2)得到的转基因胚胎移植入代孕鼠子宫，饲养并待小鼠出生，设计三对引物分别对5’插入位点、3’插入位点和EML4‑ALK L1196M基因进行PCR鉴定，筛选全部阳性的转基因小鼠；(4)转基因阳性的小鼠饲养至成年，把含有CRE重组蛋白酶基因的病毒从鼻腔滴入小鼠肺中，从而将肺上皮细胞中的EML4‑ALK L1196M癌基因激活，20天后小鼠得肺腺癌；通过CT检测和病理切片证实肺癌组织的存在；(5)对小鼠给药，给药结束，CT检测肺癌大小，与治疗前的大小进行比较；(6)治疗结束后，处死小鼠，制备小鼠肺组织的病理切片，读取病理切片上的肺癌病理变化；再与CT检测结果结合，判断药物治疗EML4‑ALK L1196M驱动肺癌的能力。...

【技术特征摘要】
1.一种评价药物对EML4-ALKL1196M癌基因驱动的肺癌治疗效果的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)利用PCR方法扩增EML4-ALKL1196M基因片段并在其5’端和3’端分别加上EcoRI和NotI酶切位点，将所得到的片段连接到pClatent质粒上，得到pClatent-EML4-ALKL1196M质粒；用PCR方法扩增小鼠ROSA26位点两段序列作为同源臂，分别通过EcoRV和PacI、EcoRV和AscI插入到pClatent-EML4-ALKL1196M质粒上，从而得到mRosa-lsl-EML4-ALKL1196M质粒；用EcoRV酶将质粒上的载体片段切掉，得到5’mROSA-CAG-lox-stop-lox-EML4-ALKL1196M-3’mROSA基因片段；步骤(1)所述的加上酶切位点的EML4-ALKL1196M基因片段的序列如SEQ.ID.NO.1所示；步骤(1)所述小鼠ROSA26位点两段序列分别如SEQ.ID.NO.9和SEQ.ID.NO.10所示；步骤(1)所述的5’-mROSA-CAG-lox-stop-lox-EML4-ALKL1196M-3’mROSA基因片段其序列如SEQ.ID.NO.11所示；(2)将Cas9mRNA片段、gRNA片段和可诱导表达EML4-ALKL1196M的转基因片段5’mROSA-CAG-lox-stop-lox-EML4-ALKL1196M-3’mROSA混合，通过显微注射将混合物注射到小鼠的胚胎中，cas9在gRNA的引导下切开ROSA26位点，通过同源重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈良，高磊，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44