一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，本发明专利技术采用化学转化的方法将外源DNA导入宿主细胞，利用宿主细胞中事先导入的λ‑Red同源重组系统和CRISPR系统成功实现大肠杆菌基因敲除。与现有大肠杆菌基因敲除方法相比，本发明专利技术提供的方法能够在大肠杆菌中实现高效准确的目的基因敲除工作。本发明专利技术提供的细菌中基因敲除方法操作简便快捷，对实验装置无特殊要求，实验成本较低，尤其适用于高通量基因敲除工作。

A method of chemical conversion mediated gene knockout of Escherichia coli based on CRISPR/Cas9 system

The invention discloses a CRISPR/Cas9 knockout method based on Escherichia coli gene by chemical transformation mediated by the method of the invention uses the chemical conversion of DNA gene was transformed into the host cell, the successful implementation of the Escherichia coli gene knockout using host cells in advance into the lambda Red homologous recombination system and CRISPR system. Compared with the existing method of gene knockout of Escherichia coli, the method provided by the present invention can achieve efficient and accurate target gene knockout in Escherichia coli. The gene knockout method in bacteria provided by the invention is simple and quick to operate, has no special requirement for the experimental device, and has low experimental cost, and is especially suitable for high-throughput gene knockout.

【技术实现步骤摘要】
一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法(一)
本专利技术涉及基因敲除
，具体涉及由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统的特异性敲除大肠杆菌中染色体靶标基因的方法。(二)
技术介绍
大肠杆菌(Escherichiacoli)广泛应用于基因工程、遗传工程、发酵工程、代谢工程等领域，具广阔的应用前景。基因敲除涉及外源DNA导入及其与染色体DNA同源重组。Datsenko和Wanner通过导入λ-Red同源重组系统大幅提高大肠杆菌的重组效率，专利技术了一步敲除大肠杆菌染色体基因技术(Datsenko&Wanner，PNAS,2000,97:6640-6645)。CRISPR系统可导致靶标基因相应区域产生双链断裂，结合λ-Red同源重组系统可进一步提高大肠杆菌基因敲除的效率(Jiangetal.，NatBiotechnol，2013，31:233-9；Jiangetal.，ApplEnvironMicrobiol，2015，81:2506-2514；Zhaoetal.，MicrobCellFact，2016，15:205)。目前采用较广泛本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，其特征在于所述方法为：(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌BL21，获得大肠杆菌BL21 pCas9；(2)根据靶标基因设计1对反向互补的引物，所述引物中的一条含靶标基因20个核苷酸序列，以pTargetF质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的pTargetF质粒，即为辅助质粒pTargetF；(3)构建携带选择性标记和待敲除基因上下游同源序列的DNA片段；(4)将步骤(2)获得的辅助质粒pTargetF和步骤(3)获得的DNA片段通过化学转化的方法转入大肠杆菌...

【技术特征摘要】
1.一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，其特征在于所述方法为：(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌BL21，获得大肠杆菌BL21pCas9；(2)根据靶标基因设计1对反向互补的引物，所述引物中的一条含靶标基因20个核苷酸序列，以pTargetF质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的pTargetF质粒，即为辅助质粒pTargetF；(3)构建携带选择性标记和待敲除基因上下游同源序列的DNA片段；(4)将步骤(2)获得的辅助质粒pTargetF和步骤(3)获得的DNA片段通过化学转化的方法转入大肠杆菌BL21pCas9感受态细胞，获得敲除靶标基因的大肠杆菌。2.如权利要求1所述由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，其特征在于步骤(4)中辅助质粒pTargetF和DNA片段质量比为1:1～1:10。3.如权利要求1所述由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，其特征在于步骤(4)转入方法为：将辅助质粒pTargetF和DNA片段与大肠杆菌BL21pCas9感受态细胞混合，冰浴30min，然后42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入30℃预热的LB培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h，离心弃上清大部分，剩余上清跟沉淀混匀，取混合液涂布于选择性LB琼脂培养基上，30℃培养12～24h，挑取转化子，划线到选择性LB琼脂培养基上复筛，获得敲除靶标基因的大肠杆菌。4.如权利要求1所述基于由化学转化介导的CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙东昌，裘娟萍，王琳，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33