一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，本发明专利技术采用化学转化的方法将外源DNA导入宿主细胞，利用宿主细胞中事先导入的λ‑Red同源重组系统和CRISPR系统成功实现大肠杆菌基因敲除。与现有大肠杆菌基因敲除方法相比，本发明专利技术提供的方法能够在大肠杆菌中实现高效准确的目的基因敲除工作。本发明专利技术提供的细菌中基因敲除方法操作简便快捷，对实验装置无特殊要求，实验成本较低，尤其适用于高通量基因敲除工作。

A method of chemical conversion mediated gene knockout of Escherichia coli based on CRISPR/Cas9 system

The invention discloses a CRISPR/Cas9 knockout method based on Escherichia coli gene by chemical transformation mediated by the method of the invention uses the chemical conversion of DNA gene was transformed into the host cell, the successful implementation of the Escherichia coli gene knockout using host cells in advance into the lambda Red homologous recombination system and CRISPR system. Compared with the existing method of gene knockout of Escherichia coli, the method provided by the present invention can achieve efficient and accurate target gene knockout in Escherichia coli. The gene knockout method in bacteria provided by the invention is simple and quick to operate, has no special requirement for the experimental device, and has low experimental cost, and is especially suitable for high-throughput gene knockout.

【技术实现步骤摘要】
一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法(一)
本专利技术涉及基因敲除
，具体涉及由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统的特异性敲除大肠杆菌中染色体靶标基因的方法。(二)
技术介绍
大肠杆菌(Escherichiacoli)广泛应用于基因工程、遗传工程、发酵工程、代谢工程等领域，具广阔的应用前景。基因敲除涉及外源DNA导入及其与染色体DNA同源重组。Datsenko和Wanner通过导入λ-Red同源重组系统大幅提高大肠杆菌的重组效率，专利技术了一步敲除大肠杆菌染色体基因技术(Datsenko&Wanner，PNAS,2000,97:6640-6645)。CRISPR系统可导致靶标基因相应区域产生双链断裂，结合λ-Red同源重组系统可进一步提高大肠杆菌基因敲除的效率(Jiangetal.，NatBiotechnol，2013，31:233-9；Jiangetal.，ApplEnvironMicrobiol，2015，81:2506-2514；Zhaoetal.，MicrobCellFact，2016，15:205)。目前采用较广泛的外源DNA导入细菌的方法包括电转化和化学转化。前者转化效率高，但是依赖电转化仪、电击杯等装置，因此实验成本相对较高，操作相对较繁琐；后者虽然转化效率相对较低，但是不依赖特殊装置，实验成本低，操作简便。基于λ-Red同源重组系统或CRISPR系统的大肠杆菌基因敲除技术一般通过电转化的方法将外源DNA导入细胞。目前，尚没有文献报道化学转化方法结合λ-Red同源重组系统或CRISPR系统开展大肠杆菌基因敲除的成功案例。利用λ-Red同源重组的基因敲除技术是一种常用基因打靶技术，是将一段携带与靶基因两翼同源序列的DNA片段导入宿主菌细胞，利用入噬菌体Red重组酶(Gam、Bel、Exo3种蛋白)的作用，使线性DNA片段与染色体的特定靶序列进行同源重组，靶基因被标记基因置换下来。该方法所需打靶同源臂短，可以直接设计在引物上，不需要DNA酶切和连接等程序，但是同源重组技术重组效率低，对突变体的筛选工作非常耗时和低效。CRISPR是一种源于原核生物的后天免疫系统，系统中执行DNA识别和降解功能的复合物由Cas蛋白和crRNA组成。该系统有三种类型，其中第二类Cas9系统组成简单，已经被广泛应用于基因工程领域。Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA——crRNA和tracrRNA与靶序列互不识别来实现的。现在已经将这两种小RNA融合成一条链，简称sgRNA，能够识别特定的基因序列，引导Cas9蛋白进行切割。现有的CRISPR技术敲除大肠杆菌基因的体系结合Cas9蛋白和λ-Red同源重组系统实现靶标基因敲除工作，操作简单、筛选效率高，能够实现精确快速的靶向切割，但是需要通过电转化的方法将外源DNA导入宿主细胞，对DNA片段的纯度以及感受态细胞的制备等方面要求较高。开展电转化操作需要较特殊的电转化设备(电转仪)和较昂贵的实验耗材(电击杯)，因此不适合同时开展大量单基因敲除工作。本专利技术采用化学转化的方法开展大肠杆菌基因敲除工作，无需电转仪和电击杯即可实现快速、高效、准确的靶标基因敲除工作，且基因敲除操作成本低廉，可同时实现大肠杆菌多个单基因敲除，适合大规模高通量基因功能筛选和鉴定工作。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统的简便而快速敲除大肠杆菌染色体基因的方法，该方法扩增任一靶标基因缺失的大肠杆菌，得到携带选择性标记的同源臂DNA片段；采用化学转化的方法将该DNA片段和辅助质粒导入宿主细胞，可以对大肠杆菌中敲除效率相对较低的系列菌株中靶标基因快速、高效、准确敲除。此外本专利技术提供的技术为没有电转仪的实验室开展大肠杆菌基因敲除提供便捷的方法，为大肠杆菌的菌种研究和改良提供了有效手段并显著降低了成本。本专利技术采用化学转化的方法将外源DNA导入宿主细胞，利用宿主细胞中事先导入的λ-Red同源重组系统和CRISPR系统成功实现大肠杆菌基因敲除。与现有大肠杆菌基因敲除方法相比，本专利技术提供的方法能够在大肠杆菌中实现高效准确的目的基因敲除工作。本专利技术提供的细菌中基因敲除方法操作简便快捷，对实验装置无特殊要求，实验成本较低，尤其适用于高通量基因敲除工作。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，所述方法为：(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌BL21，获得大肠杆菌BL21pCas9；(2)根据靶标基因设计一对反向互补的引物，所述引物中的一条含靶标基因20个核苷酸序列(N20)，以pTargetF质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的pTargetF质粒，即为辅助质粒pTargetF；所述筛选是指PCR产物经纯化后回收，用DpnⅠ处理回收，导入大肠杆菌感受态细胞，挑取转化子，送去测序验证，提取含靶标基因20个核苷酸序列的pTargetF质粒；(3)以敲除靶标基因的大肠杆菌为模板，根据待敲除靶标基因位点上下游核苷酸序列设计引物，菌落PCR扩增含选择性标记基因(优选氯霉素抗性基因)和拟敲除靶标基因上下游同源DNA序列的DNA片段；(4)将步骤(2)获得的辅助质粒pTargetF和步骤(3)获得的DNA片段通过化学转化方法转入大肠杆菌BL21pCas9感受态细胞，获得敲除靶标基因的大肠杆菌。进一步，步骤(4)辅助质粒pTargetF和DNA片段质量比为1:1～1:10，优选1:4。进一步，步骤(4)转入方法为：将辅助质粒pTargetF和DNA片段与大肠杆菌BL21pCas9感受态细胞混合，冰浴30min，然后42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入30℃预热的LB培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h，离心弃上清大部分，剩余上清跟沉淀混匀，取混合液涂布于选择性的LB琼脂培养基上，30℃培养12～24h，挑取转化子，划线到选择性的LB琼脂培养基上复筛，获得敲除靶标基因的大肠杆菌；所述选择性LB琼脂培养基为含终浓度25μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基。进一步，当靶标基因为panD基因，所述方法为：(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌BL21，获得大肠杆菌BL21pCas9；(2)根据靶标基因设计1对反向互补的引物pTargetF-panD1(含靶标基因20个核苷酸序列(N20)和pTargetF-panD2，以pTargetF质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的pTargetF质粒，即为辅助质粒pTargetF；pTargetF-panD1:GTCCTAGGTATAATACTAGTGATATCTGGAATGTCACCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；pTargetF-panD2:ACTAGTATTATACCTAGGACTGAG；(3)以敲除目标基因的大肠杆菌为模板，根据待敲除基因位点上下游核苷酸序列设计引物F和R，菌落PCR扩增筛选出含选择性标记基因和拟敲除靶标基因上下游同源DNA序列的DNA片段；F：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，其特征在于所述方法为：(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌BL21，获得大肠杆菌BL21 pCas9；(2)根据靶标基因设计1对反向互补的引物，所述引物中的一条含靶标基因20个核苷酸序列，以pTargetF质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的pTargetF质粒，即为辅助质粒pTargetF；(3)构建携带选择性标记和待敲除基因上下游同源序列的DNA片段；(4)将步骤(2)获得的辅助质粒pTargetF和步骤(3)获得的DNA片段通过化学转化的方法转入大肠杆菌BL21 pCas9感受态细胞，获得敲除靶标基因的大肠杆菌。

【技术特征摘要】
1.一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，其特征在于所述方法为：(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌BL21，获得大肠杆菌BL21pCas9；(2)根据靶标基因设计1对反向互补的引物，所述引物中的一条含靶标基因20个核苷酸序列，以pTargetF质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的pTargetF质粒，即为辅助质粒pTargetF；(3)构建携带选择性标记和待敲除基因上下游同源序列的DNA片段；(4)将步骤(2)获得的辅助质粒pTargetF和步骤(3)获得的DNA片段通过化学转化的方法转入大肠杆菌BL21pCas9感受态细胞，获得敲除靶标基因的大肠杆菌。2.如权利要求1所述由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，其特征在于步骤(4)中辅助质粒pTargetF和DNA片段质量比为1:1～1:10。3.如权利要求1所述由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，其特征在于步骤(4)转入方法为：将辅助质粒pTargetF和DNA片段与大肠杆菌BL21pCas9感受态细胞混合，冰浴30min，然后42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入30℃预热的LB培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h，离心弃上清大部分，剩余上清跟沉淀混匀，取混合液涂布于选择性LB琼脂培养基上，30℃培养12～24h，挑取转化子，划线到选择性LB琼脂培养基上复筛，获得敲除靶标基因的大肠杆菌。4.如权利要求1所述基于由化学转化介导的CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙东昌，裘娟萍，王琳，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33