The invention relates to a donor building, as well as a gene knockout method, as well as a system and a kit. The invention of the gene knockout method through non homologous end joining the donor construct inserted into double strand breaks in the genome of the cell location marker gene contains the marker expression by gene knockout cells were enriched and improved by sequence specific nuclease producing gene knockout efficiency.
【技术实现步骤摘要】
基因敲除方法专利
本专利技术涉及基因编辑技术,具体涉及基因敲除方法。
技术介绍
基因编辑技术彻底改变了对基因功能的实验研究。三种主要的技术,ZFN(锌指核酸酶)[1],TALENs(转录激活物样效应子核酸酶)[2-4]和CRISPR/Cas9系统[5-7],使用不同的机制产生序列特异性双链断裂(double-strandbreaks,DSBs)并随后引发天然修复系统完成序列特异性修饰[8,9]。这些技术在功能基因研究[10]、染色体位点的动态和实时成像[11,12]、疾病突变的校正[13]、基因治疗[14]等方面具有广泛的应用。CRISPR/Cas9系统因其高效性和易于操作,变得特别受欢迎。CRISPR/Cas9系统原本被细菌免疫系统用来抵御外源病毒或质粒,在II类CRISPR系统中,Cas9核酸内切酶在sgRNA的引导下切割双链DNA,造成基因组双链断裂,利用细胞基因组修复的不稳定性产生修复错误(碱基的缺失或插入),从而产生基因编辑的效果。虽然CRISPR/Cas9系统在基于设计的和序列特异性的基因组研究中具有前所有未有的优势,但CRISPR/Cas9系统引发的基因编辑在细胞群体中仍然属于稀有事件,要得到真正的基因被编辑的单克隆,需要进行繁琐的劳动,因此该系统在技术上仍然具有挑战性,即使是对于在哺乳动物细胞中产生基因敲除这样的简单任务来说[15]。已进行了各种努力来提高产生基因敲除的方案的效率,例如整合CRISPR/Cas9系统以永久表达Cas9和sgRNA[16]、预先产生稳定表达Cas9的细胞系[17]、增强非同源末端连接(NHEJ)途径[18]、通 ...
【技术保护点】
提供供体构建体,所述供体构建体是线性供体DNA或可在细胞中被切割产生线性供体DNA,所述线性供体DNA由中间向两端依次包含:表达盒;位于表达盒5'端的由反向终止密码子组成的短的序列延伸和位于表达盒3'端的由正向终止密码子组成的短的序列延伸;位于5'端和/或3'端的靶序列,所述靶序列含有可被所述序列特异性核酸酶切割的靶位点;位于两端的保护序列;其中所述表达盒包含由启动子驱动的标记物基因;优选,所述序列特异性核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)、Cas9核酸酶、或NgAgo核酸酶;优选,所述线性供体DNA仅在5'端或3'端具有靶序列,或所述线性供体DNA在两端分别具有靶序列;进一步优选,所述线性供体DNA中两端的靶序列不同;更进一步优选,所述线性供体DNA中两端的不同靶序列来自于相同的基因,或所述线性供体DNA中两端的不同靶序列来自于不同的基因;优选,所述标记物基因是抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。
【技术特征摘要】
1.提供供体构建体,所述供体构建体是线性供体DNA或可在细胞中被切割产生线性供体DNA,所述线性供体DNA由中间向两端依次包含:表达盒;位于表达盒5'端的由反向终止密码子组成的短的序列延伸和位于表达盒3'端的由正向终止密码子组成的短的序列延伸;位于5'端和/或3'端的靶序列,所述靶序列含有可被所述序列特异性核酸酶切割的靶位点;位于两端的保护序列;其中所述表达盒包含由启动子驱动的标记物基因;优选,所述序列特异性核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)、Cas9核酸酶、或NgAgo核酸酶;优选,所述线性供体DNA仅在5'端或3'端具有靶序列,或所述线性供体DNA在两端分别具有靶序列;进一步优选,所述线性供体DNA中两端的靶序列不同;更进一步优选,所述线性供体DNA中两端的不同靶序列来自于相同的基因,或所述线性供体DNA中两端的不同靶序列来自于不同的基因;优选,所述标记物基因是抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。2.在细胞中产生基因敲除的方法,所述方法包括以下步骤:(1)向细胞中引入能切割细胞基因组中特定靶位点的序列特异性核酸酶和供体构建体;其中所述供体构建体是线性供体DNA或可在细胞中被切割产生线性供体DNA,所述线性供体DNA由中间向两端依次包含:表达盒;位于表达盒5'端的由反向终止密码子组成的短的序列延伸和位于表达盒3'端的由正向终止密码子组成的短的序列延伸;位于5'端和/或3'端的靶序列,所述靶序列含有可被所述序列特异性核酸酶切割的靶位点;位于两端的保护序列;所述表达盒包含由启动子驱动的标记物基因;其中线性供体DNA通过非同源末端连接被插入到细胞基因组中的特定靶位点;(2)筛选所述标记物表达阳性的细胞;优选,所述基因敲除是单个基因敲除或多基因敲除;优选,所述标记物基因是抗生素抗性基因或荧光蛋白基因;进一步优选,步骤(2)中通过药物抗性筛选细胞,或步骤(2)中通过FACS方法筛选细胞。3.权利要求2的方法,其中所述序列特异性核酸酶是锌指核酸酶(ZFN),或转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)。4.权利要求2的方法,其中所述序列特异性核酸酶是Cas9核酸酶;优选,步骤(1)中还包括向细胞中引入识别细胞基因组中特定靶位点的sgRNA,其中线性供体DNA中的靶序列包含被所述sgRNA识别的靶位点。5.权利要求4的方法,其中所述sgRNA识别细胞基因组中单个特定靶位点,包含被所述gRNA识别的靶位点的靶序列位于线性供...
【专利技术属性】
技术研发人员:魏文胜,周悦欣,张鸿敏,
申请(专利权)人:北京大学,
类型:发明
国别省市:北京,11
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