降低CRISPR/Cas9介导的胚胎基因编辑脱靶率的方法技术

降低CRISPR/Cas9介导的胚胎基因编辑脱靶率的方法，包括合成靶向基因的sgRNA序列，并构建携带T7启动子的sgRNA表达质粒；体外转录Cas9mRNA及sgRNA；以及采取卵胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)将单精子导入未受精的MII期卵子，并同时导入Cas9mRNA及sgRNA。使用本发明专利技术方法的靶向编辑效率高，脱靶突变率低。

A method to reduce the Miss target rate of CRISPR/Cas9 mediated gene editing

Reduce the embryo mediated CRISPR/Cas9 gene editing method of miss rate, including the synthesis of targeting sgRNA gene sequences, and construct T7 promoter sgRNA expression plasmid; in vitro transcription of Cas9mRNA and sgRNA; and take the technology of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) intracytoplasmic single sperm into unfertilized MII oocytes. And at the same time into Cas9mRNA and sgRNA. The method of this invention has high target editing efficiency and low miss target mutation rate.

【技术实现步骤摘要】
降低CRISPR/Cas9介导的胚胎基因编辑脱靶率的方法
本专利技术涉及基因编辑，具体涉及如何降低CRISPR/Cas9介导的胚胎基因编辑的脱靶率。
技术介绍
伴随遗传学和基因组学新时代的到来，先进的DNA测序技术发现了调控个体发育异常的分子密码。基因编辑，曾经被称为基因打靶技术，主要依赖特异的碱基互补配对原则修改基因组DNA序列。目前，大多数的基因组编辑借助自定义的内切酶得以实现，包括锌指结构核酸酶(ZFNs)，转录激活样效应核酸酶(TALENs)以及CRISPR-Cas9系统。ZFNs及TALENs技术需要复杂的蛋白质装配工程，而CRISPR-Cas9系统可以通过替换引导RNA轻松地完成。因此，作为一个高效，设计简便，使用方便，多重靶向编辑的基因编辑工具，CRISPR-Cas9系统被广泛应用于各项研究，成为当前主流的基因编辑工具，为实现精准的基因编辑带来希望。CRISPR/Cas9系统目前已应用于体外的人诱导多能干细胞及初始T细胞的基因编辑研究中，我们也进一步证明基因编辑可以增强T细胞的功能[Suetal.,2016]。然而对于很多遗传疾病的研究，例如肌强直性营养不良，遗传性线粒体疾病等，仅限于对体细胞的基因编辑的研究，并不能达到预防疾病的目的，因而，对生殖细胞的基因编辑的研究，可以有助于进一步理解不孕症及早期胚胎发育中的一些关键科学问题。在人类胚胎研究中，已证实受精卵中显微注射ZFN,TALEN及Cas9等核酸酶，可以实现多个物种二倍体胚胎中DNA、mRNA或蛋白水平的基因编辑。目前仅在异常受精的、不能发育为存活胚胎的三原核受精卵中做了有关Cas9的研究，但发现CRISPR/Cas9系统存在效率及准确率受限的不足，尤其是在研究中频繁出现的脱靶现象。虽有多种方法尝试改善CRISPR/Cas9基因编辑技术高频的脱靶现象，但仍不能避免其带来的各种突变缺陷。因而进一步降低CRISPR/Cas9介导的对人二倍体胚胎基因编辑的脱靶效应尤为迫切。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种降低CRISPR/Cas9介导的胚胎基因编辑脱靶率的方法。本专利技术基于二倍体胚胎能完全排除三原核受精卵带来的未知因素干扰，为检测基因靶向效应提供良好的研究模型，通过在卵子受精瞬间同时导入Cas9mRNA以及sgRNA来实现基因编辑。根据本专利技术的降低CRISPR/Cas9介导的胚胎基因编辑脱靶率的方法包括：合成靶向基因的sgRNA序列，并构建携带T7启动子的sgRNA表达质粒；体外转录Cas9mRNA及sgRNA；以及采取卵胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)将单精子导入未受精的MII期卵子，并同时导入Cas9mRNA及sgRNA。本专利技术的方法还可以包括：对所得受精卵进行胚胎培养和评估。根据本专利技术的优选实施例，所述Cas9mRNA为Cas9切口酶mRNA，所述sgRNA为两个相邻位置的sgRNA。这种情况下，所述sgRNA进一步优选为sgRNA-E和sgRNA-1，它们距离RAG1基因编码位点11bp。本专利技术利用IVF过程中无法正常受精的废弃卵子，通过同时导入精子、Cas9mRNA以及sgRNA(优选Cas9mRNA和双sgRNA)使其受精形成二倍体胚胎，并进行了CRISPR/Cas9介导的基因编辑测试。通过深度测序及T7EN1裂解实验详细分析CRISPR/Cas9在人类二倍体胚胎的基因编辑的特异性，可以看出，使用本专利技术方法的靶向编辑效率很高，脱靶突变率很低，通过采取Cas9切口酶/双sgRNA策略能够成功地降低脱靶突变率。此外，CRISPR/Cas9系统还能诱导多重基因靶向，证明其在人类胚胎的基因编辑中用途广泛、容易操控。附图说明图1是荧光原位杂交方法检测ICSI注射后受精并可发育的二倍体胚胎。图2是通过T7EN1裂解实验在废弃卵子来源的胚胎中检测Cas9介导的靶向RAG1基因裂解，其中，所用sgRNA为RAG1-sgRNA-E。从人胚胎基因组DNA中经PCR扩增得到RAG1基因位点的靶向区域。PCR的产物(上)经过T7EN1裂解分析(下)。WT，野生对照。图3是通过T7EN1裂解实验在废弃卵子来源的胚胎中检测Cas9介导的靶向RAG1基因裂解，其中，所用sgRNA为RAG1-sgRNA-1。从人胚胎基因组DNA中经PCR扩增得到RAG1基因位点的靶向区域。PCR的产物(上)经过T7EN1裂解分析(下)。PCR扩增所用的引物显示在表1中。图4是废弃卵子来源的胚胎中修饰编辑后的RAG1基因序列。PAM序列用下划线标记，靶向序列用淡色标记，突变序列用淡色、小写字母标记；缺失(-)，插入(+)。N/N代表测序过程中的阳性比例。图5是RAG1-sgRNA-E的可能脱靶位点的PCR产物分析。从3、4、6、7、14和21号胚胎扩增与RAG1-sgRNA-E最为同源的25个可能脱靶位点。在PP13的7号中观察到了突变带。WT，野生对照。图6是通过T7EN1裂解实验分析RAG1-sgRNA-E可能的脱靶位点。T7EN1裂解实验检测从3、4、6、7、14和21号胚胎扩增出与RAG1-sgRNA-E最为同源的25个可能脱靶位点。其中7号胚胎潜在的PP13位点的突变通过深度测序确认。WT，野生对照。图7是RAG1-sgRNA-1的可能脱靶位点的PCR产物分析。从68、70、72、78、80和82号胚胎扩增与RAG1-sgRNA-1最为同源的12个可能脱靶位点。均未观察到突变带。WT，野生对照。图8是通过T7EN1裂解实验分析RAG1-sgRNA-1可能的脱靶位点。T7EN1裂解实验检测从68、70、72、78、80和82号胚胎扩增出与RAG1-sgRNA-1最为同源的12个可能脱靶位点。72、80和82号潜在的PP29位点的突变未通过深度测序确认。WT，野生对照。图9是Cas9/sgRNA介导废弃卵子来源的胚胎中基因多位点编辑，废弃卵子来源的胚胎中RAG1基因靶向序列的PCR产物。从胚胎基因组DNA中PCR扩增RAG1的靶向序列。PCR扩增使用的引物显示在表1中。WT，野生型。图10是Cas9/sgRNA介导废弃卵子来源的胚胎中基因多位点编辑，通过T7EN1裂解实验验证Cas9/sgRNA介导的RAG1基因不同序列的靶向裂解。对图9中获得的PCR产物进行T7EN1裂解分析。图11是Cas9/sgRNA介导废弃卵子来源的胚胎中基因多位点编辑，废弃卵子来源的胚胎中RAG1等位基因修饰编码后的序列。PAM序列用下划线标记；靶向序列用淡色标记；突变序列用淡色、小写字母标记；缺失(-)，插入(+)。N/N代表测序过程中的阳性比例。图12是Cas9切口酶/双sgRNA介导废弃卵子来源的胚胎中基因编辑，废弃卵子来源的胚胎中RAG1基因靶向序列的PCR产物。从胚胎基因组DNA中PCR扩增RAG1的靶向序列。PCR扩增使用的引物显示在表1中。WT，野生型。图13是Cas9切口酶/双sgRNA介导废弃卵子来源的胚胎中基因编辑，通过T7EN1裂解实验验证Cas9/sgRNA介导的RAG1基因不同序列的靶向裂解。对图11中获得的PCR产物进行T7EN1裂解分析。图14是Cas9切口酶/双sgRNA介导废弃卵子来源的胚胎中基因编辑，废弃卵子来源的胚胎中RAG1等位基因修饰本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降低CRISPR/Cas9介导的胚胎基因编辑脱靶率的方法，包括：合成靶向基因的sgRNA序列，并构建携带T7启动子的sgRNA表达质粒；体外转录Cas9mRNA及sgRNA；以及采取卵胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)将单精子导入未受精的MII期卵子，并同时导入Cas9mRNA及sgRNA。

【技术特征摘要】
1.一种降低CRISPR/Cas9介导的胚胎基因编辑脱靶率的方法，包括：合成靶向基因的sgRNA序列，并构建携带T7启动子的sgRNA表达质粒；体外转录Cas9mRNA及sgRNA；以及采取卵胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)将单精子导入未受精的MII期卵子，并同时导入Cas9mRNA及sgRNA。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：孙海翔，李朝军，黄行许，颜桂军，周建奎，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32