治疗血红蛋白病的材料和方法技术

本申请提供用于治疗血红蛋白病的材料和方法。更具体地，本申请提供用于产生通过基因组编辑增加胎血红蛋白(HbF)的产生而经遗传修饰的祖细胞的方法，以及产生增加水平的HbF的经修饰的祖细胞(包括例如CD34

Materials and methods for the treatment of hemoglobin

The present application provides materials and methods for the treatment of hemoglobin. More specifically, this application provides methods for generating progenitor cells modified by genetic editing, increasing fetal hemoglobin (HbF), and modifying progenitor cells that produce increased HbF, including, for example, CD34.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】治疗血红蛋白病的材料和方法相关申请的交叉引用本申请要求提交于2015年2月23日的美国临时专利申请序列号62/119,754的权益，该美国临时专利申请全文以引用方式并入本文。序列表的引入序列表在此被提供为标题为“49064PCT1_Seqlisting.txt”的文本文件，该文本文件创建于2016年2月23日并且具有47,138字节的大小。此序列表的内容全文以引用方式并入本文。
本申请提供用于治疗血红蛋白病的材料和方法。更特别地，本申请提供用于产生通过基因组编辑增加胎血红蛋白(HbF)的产生而经遗传修饰的祖细胞的方法，以及产生增加水平的HbF的经修饰的祖细胞(包括例如CD34+人造血干细胞(hHSC))，以及使用这种细胞治疗血红蛋白病(诸如镰状细胞性贫血和β-地中海贫血)的方法。
技术介绍
血红蛋白病涵盖与遗传决定的血红蛋白结构或表达方面的变化相关的多种贫血。这些包括对血红蛋白链的分子结构的改变，诸如伴随镰状细胞性贫血发生的，以及其中一个或更多个链的合成减少或缺乏的变化，诸如在多种地中海贫血中所发生的。与β-球蛋白特别相关的疾病通常被称为β-血红蛋白病。例如，β-地中海贫血是由于β球蛋白基因表达的部分或完全缺陷导致血红蛋白A(HbA)缺乏或不存在。HbA是最常见的人血红蛋白四聚体并且由两个α-链和两个β链组成(α2β2)。β-地中海贫血是由于染色体11上的成体β-球蛋白基因(HBB)的突变，并以常染色体隐性方式遗传。β-地中海贫血(β-thalassemia或β-thal)分为通过症状严重程度区分的两种临床显著类型(这是症状管理、医学治疗和本申请的焦点)：重型β-地中海贫血症(或β0，其中突变阻断β-球蛋白链的产生，从而导致也被称为“库利氏贫血(Cooley'sanemia)”的严重病症)，以及中间型β-地中海贫血(或β+，其中突变减少但不阻断β-球蛋白的产生的中间病症)。相比之下，轻型β-地中海贫血或轻度β-地中海贫血是指其中仅一个β-球蛋白等位基因中含有突变，使得可以通过从另一(即未突变)染色体11等位基因的表达产生β-球蛋白链的杂合情况。虽然这种个体是可能遗传给他们的孩子的β-地中海贫血突变等位基因的携带者，但是由于从未受影响的等位基因产生β-球蛋白，所以患有轻型β-地中海贫血的个体自身通常无症状或几乎无症状。重型地中海贫血的病征和症状通常出现在生命的头2年，此期间患有这种疾病的儿童可能会发展出危及生命的贫血。患有重型地中海贫血的儿童往往不能以预期的速率获得足够的体重或生长(发育不良)，并可能发展出黄疸。受影响的个体也可能具有脾脏、肝脏和心脏肿大，并且这些个体的骨骼也可能畸形。许多患有重型地中海贫血的人具有需要频繁输血来补充他们的红血细胞供应的严重症状，其被称为输血依赖性地中海贫血。虽然输注已经成为许多患者的关键救生手段，但是输注是昂贵的并且经常与显著的副作用相关。除了别的以外，随着时间的推移，来自长期输血的含铁血红蛋白的施用趋向于导致体内铁的积累，这可能导致肝脏、心脏和内分泌问题。中间型地中海贫血比重型地中海贫血更轻度。中间型地中海贫血的病征和症状出现在儿童期早期或生命的稍后时期中。虽然症状不那么严重，但受影响的个体仍然具有轻度至中度贫血并且还可能遭受缓慢生长和骨骼畸形。镰状细胞病(SCD)是一组影响全球数百万人的疾病。这种疾病在居住在非洲；地中海国家，诸如希腊、土耳其和意大利；阿拉伯半岛；印度；中美洲和南美洲中的西班牙语地区，以及加勒比的部分地区或其祖先来自于上述的人中最常见。然而，SCD也是美国最常见的遗传性血液疾病。SCD包括镰状细胞性贫血，以及镰状血红蛋白C疾病(HbSC)，镰状β加地中海贫血(HbS/β+)和镰状β零地中海贫血(HbS/β0)。镰状细胞性贫血(SCA)是最普遍存在的SCD形式，是世界上最常见的严重单基因遗传病之一，每年大约有25万儿童生来患有SCD。西非和中非地区的SCA发病率最高，其中1％至2％的婴儿生来患有该疾病，并且多达25％的人是杂合携带者。SCA点突变被认为已经通过选择性优势传播，因为杂合性提供抗儿童疟疾死亡的适度保护。在疟疾同样普遍存在的印度，据估计存在超过250万名SCA杂合携带者和大约15万患有该疾病的纯合体。尽管北美和欧洲疟疾相对不存在，但是事实上北美和欧洲各自有大量具有受影响地区遗传来源的群体，这意味着北美和欧洲地区都有大量的杂合性SCA携带者群体，以及由此造成的受影响的纯合个体。例如，美国疾病控制中心(CDC)估计，存在约90,000到100,000名美国人患有SCA；而在西欧国家，特别是具有大量移民人口的那些国家发病率也很高，例如估计在法国为10,000人，而在英国则为12,000至15,000人。医疗保健系统的相关成本同样很大。在1989年至1993年进行的为期五年的美国研究中，CDC估计，每年SCD导致大于75,000次住院，费用为约5亿美元。现鉴于医疗保健成本在二十年间稳步上升，预计系统范围成本将大幅增加。所有形式的SCD均由β-球蛋白结构基因(HBB)中的突变引起。镰状细胞性贫血(SCA)是由β-球蛋白基因的第六密码子的单个错义突变(HBB；A→T)导致的由缬氨酸取代谷氨酸(Glu→Val)而引起的常染色体隐性遗传病。与正常成体血红蛋白或HbA(其为α2β2A)相比，突变型蛋白当掺入血红蛋白(Hb)时会导致不稳定的血红蛋白HbS(其为α2β2S)。在脱氧时，HbS通过红细胞系中的一个四聚体的βS-6缬氨酸与相邻四聚体的β-85苯丙氨酸和β-88亮氨酸之间的疏水相互作用聚合形成HbSS，这导致强直和血管闭塞[Atweh,Semin.Hematol.38(4):367-73(2001)]。当HbS是血红蛋白的主要形式时，如在患有SCA的个体中，他们的红细胞(RBC)倾向于变形成镰状或新月形。镰状RBC过早死亡，这可导致贫血。此外，镰状细胞比正常的RBC更不灵活并且倾向于卡在小血管中，从而引起血管闭塞事件。这种血管闭塞事件与组织缺血相关，导致急性和慢性疼痛，以及可影响体内任何器官(包括骨骼、肺、肝、肾、脑、眼睛和关节)的器官损伤。脾脏特别地受到梗塞，并且大多数患有SCD的个体在幼儿期中功能上无脾，从而增加了他们患上某些类型细菌感染的风险。小血管阻塞也可引起被称为“危象”的急性发作性发热性疾病，该疾病伴有严重的疼痛和多器官功能障碍。在几十年的过程中，存在进行性器官疾病和过早死亡。患有SCD的儿童可以通以新生儿筛查诊断出，但未诊断出的话则直到稍后当由于血红蛋白等位基因从胎血红蛋白(由HBG1(A-γ，也写作Aγ)和HBG2(G-γ，也写作Gγ)编码)“转换”成由HBB编码的成体β形式)而使胎血红蛋白(HbF)水平下降并且HbS水平升高时才会呈现出。从HbF到成体形式的β-球蛋白(即未受影响的儿童体内中的HbA或患有SCA的那些儿童体内中的HbS)的转换通常在出生前几个月开始，并且在约6月龄时完成。SCD的临床效力直到HbF水平变成相对于HbS显著低时才明显，这通常在出生后两至三个月发生。SCD通常首先表现为趾炎或“手足综合征”，这是一种可能伴有肿胀的与手和/或足疼痛相关的病症。此外，脾脏可能会变成充满血细胞，从而导致被称为“脾隔本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过基因组编辑增加人细胞中胎血红蛋白(HbF)水平的方法，其使用DNA核酸内切酶实现一对双链断裂(DSB)，第一DSB位于人染色体11的δβ‑球蛋白区域内的5'DSB位点处，第二DSB位于人染色体11的δβ‑球蛋白区域内的3'DSB位点处，从而引起5'DSB位点与3'DSB位点之间染色体DNA缺失或倒位，这导致γ‑球蛋白的表达增加，从而增加所述细胞中HbF的水平。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.23 US 62/119,7541.一种通过基因组编辑增加人细胞中胎血红蛋白(HbF)水平的方法，其使用DNA核酸内切酶实现一对双链断裂(DSB)，第一DSB位于人染色体11的δβ-球蛋白区域内的5'DSB位点处，第二DSB位于人染色体11的δβ-球蛋白区域内的3'DSB位点处，从而引起5'DSB位点与3'DSB位点之间染色体DNA缺失或倒位，这导致γ-球蛋白的表达增加，从而增加所述细胞中HbF的水平。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA核酸内切酶是Cas9核酸内切酶、锌指核酸酶、转录激活子样效应核酸酶、归巢核酸内切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述细胞中引入编码DNA核酸内切酶的一个或更多个多核苷酸。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述细胞中引入编码DNA核酸内切酶的一个或更多个RNA。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DNA核酸内切酶是Cas9核酸内切酶，并且所述方法包括向所述细胞中引入编码Cas9的一个或更多个多核苷酸和两个向导RNA，第一向导RNA包含与所述5'DSB位点的区段互补的间隔序列，并且第二向导RNA包含与所述3'DSB位点的区段互补的间隔序列。6.根据权利要求5所述的方法，其中两个向导RNA均为单分子向导RNA。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法包括向所述细胞中引入编码Cas9的一个或更多个RNA。8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述DNA核酸内切酶是锌指核酸酶(ZFN)，并且所述方法包括向所述细胞中引入编码靶向所述5'DSB位点的区段的第一对ZFN和靶向所述3'DSB位点的区段的第二对ZFN的一个或更多个多核苷酸。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述人细胞是分离的祖细胞。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述分离的祖细胞是造血祖细胞。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述造血祖细胞能够产生红系谱系的细胞。12.根据权利要求9所述的方法，其中所述分离的祖细胞是经诱导多能干细胞。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述5'DSB位点与所述3'DSB位点之间有染色体DNA的缺失。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述5'DSB位点靠近于HPFH缺失的5'边界。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述5'DSB位点靠近于选自由以下项组成的组的HPFH缺失的5'边界：HPFH-4缺失、HPFH-5缺失、HPFH-Kenya缺失、HPFH-Black缺失、长Corfu缺失和短Corfu缺失。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述3'DSB位点靠近于HPFH缺失的3'边界。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述3'DSB位点靠近于选自由以下项组成的组的HPFH缺失的3'边界：HPFH-4缺失、HPFH-5缺失、HPFH-Kenya缺失、HPFH-Black缺失、长Corfu缺失和短Corfu缺失。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述5'DSB位点靠近于HPFH缺失的5'边界，以及所述3'位点靠近于HPFH缺失的3'边界。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述5'DSB位点靠近于选自由以下项组成的组的HPFH缺失的5'边界，以及所述3'位点靠近于选自由以下项组成的组的HPFH缺失的3'边界：HPFH-4缺失、HPFH-5缺失、HPFH-Kenya缺失、HPFH-Black缺失、长Corfu缺失和短Corfu缺失。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述缺失的3'边界靠近于Chr11:5224779，以及所述缺失的5'边界靠近于Chr11:5237723。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述缺失的3'边界靠近于Chr11:5234665，以及所述缺失的5'边界靠近于Chr11:5238138。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述缺失的3'边界靠近于Chr11:5233055，以及所述缺失的5'边界靠近于Chr11:5240389。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述缺失的3'边界靠近于Chr11:5226631，以及所述缺失的5'边界靠近于Chr11:5249422。24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述缺失的3'边界靠近于Chr11:5196709，以及所述缺失的5'边界靠近于Chr11:5239223。25.根据前述权利要求中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：马修·赫布登·波蒂厄斯，
申请(专利权)人：克里斯珀医疗股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH