生产CAR-T细胞的方法技术

本披露的各方面涉及用于生产表达嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞的方法，这些方法提供优于常规生产方法的几种改进，从而使得能够产生临床上有用的CAR T细胞疗法的稳健供应。应。应。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产CAR
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T细胞的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年11月13日提交的美国临时专利申请号62/934,999的优先权权益，该临时专利申请特此通过援引以其全文并入。

技术介绍

[0003]嵌合抗原受体(CAR)T
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细胞疗法已经在治疗血液癌中显示出有前景的治疗效果。通常，CAR
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T细胞通过患者免疫细胞(自体)或来自不相关人类供体的免疫细胞(同种异体)的基因工程而产生。高质量、临床级CAR
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T细胞的制备是该技术广泛应用的先决条件。因此，非常感兴趣的是开发用于大规模制备CAR
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T细胞的有效生产方法。

技术实现思路

[0004]本披露至少部分地基于用于生产表达嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化T细胞的方法的开发，这些方法提供优于常规生产方法的几种改进。此类改进包括但不限于本文所述的基因修饰的一致性和效率的改进(例如，三重基因组编辑的一致性和效率的改进)，这允许产生临床上有用的CAR T细胞疗法的稳健供应。
[0005]因此，本披露的一个方面提供了一种用于生产基因工程化T细胞的方法，该方法包括(i)提供第一T细胞群体；(ii)向该第一T细胞群体中引入包含第一Cas9酶和靶向CD70基因的第一引导RNA(gRNA)的第一核糖核蛋白(RNP)复合物以产生第二T细胞群体，其中该第二T细胞群体包含具有破坏的该CD70基因的T细胞；(iii)向该第二T细胞群体中引入包含第二Cas9酶和靶向T细胞受体α链恒定区(TRAC)基因的第二gRNA的第二RNP复合物以及包含第三Cas9酶和靶向β
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2微球蛋白(β2M)基因的第三gRNA的第三RNP复合物以产生第三T细胞群体，其中该第三T细胞群体包含具有破坏的该CD70基因、破坏的该TRAC基因和破坏的该β2M基因的激活的T细胞；(iv)将该第三T细胞群体与腺相关病毒(AAV)载体一起温育以产生第四T细胞群体，其中该AAV载体包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列并且其中该核酸序列的两侧有该TRAC基因的同源序列，并且其中该第四T细胞群体包含表达该CAR并具有破坏的该CD70基因、破坏的该TRAC基因和破坏的该β2M基因的激活的T细胞；(v)扩增该第四T细胞群体，从而产生扩增的T细胞群体；(vi)从该扩增的T细胞群体中去除TCRαβ
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T细胞以产生基因工程化T细胞群体，其中该基因工程化T细胞群体包含表达该CAR并具有破坏的该CD70基因、破坏的该TRAC基因和破坏的该β2M基因的激活的T细胞；以及(vii)收获该基因工程化T细胞群体。
[0006]在一些实施例中，第一T细胞群体来源于从人血细胞富集的冻存的T细胞。在一些实施例中，第一T细胞群体通过包括以下步骤的过程制备：(a)从人类供体获得血细胞；以及(b)从这些血细胞富集CD4
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T细胞和/或CD8
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T细胞。在一些实施例中，使用与抗CD4和/或抗CD8抗体缀合的磁珠进行步骤(b)。在一些实施例中，第一T细胞群体具有至少约80％的细胞活力和/或至少约80％的CD4
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和CD8
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T细胞的纯度。在一些实施例中，方法还包括(c)冻存步骤(b)中产生的富集的CD4
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T细胞和CD8
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T细胞。
[0007]在一些实施例中，通过电穿孔进行步骤(ii)。在一些实施例中，第一Cas9酶的浓度为约0.15mg/mL并且靶向CD70基因的第一gRNA的浓度为约0.16mg/mL。在一些实施例中，步骤(ii)中的细胞浓度为约100x106个细胞/mL至约400x106个细胞/mL。在一些实施例中，步骤(ii)中的细胞浓度为约100x106个细胞/mL至约350x106个细胞/mL。在一些实施例中，步骤(ii)中的细胞浓度为约300x106个细胞/mL。
[0008]在一些实施例中，这些方法还包括在步骤(ii)之后且在步骤(iii)之前，在细胞培养容器中在存在T细胞激活剂的情况下温育该第二T细胞群体以产生激活的T细胞群体的步骤，其中该激活的T细胞群体包含具有破坏的该CD70基因的激活的T细胞。该T细胞激活剂可包括CD3激动剂和CD28激动剂，并且其中该CD3激动剂和CD28激动剂附着于纳米基质颗粒。在细胞培养容器中在存在T细胞激活剂的情况下温育第二T细胞群体可以在约2x106/cm2的细胞接种密度和约2x106个细胞/mL的细胞浓度下进行约72小时。在一些实施例中，混合物中T细胞激活剂与培养基的比率为约1:12.5(v/v)。在其他实施例中，本文披露的方法还可包括在存在T细胞激活剂的情况下温育第二T细胞群体后，稀释激活的T细胞群体中的T细胞激活剂以减少激活并允许细胞在步骤(iii)之前恢复。
[0009]在一些实施例中，通过电穿孔进行步骤(iii)。在一些实施例中，步骤(iii)涉及一个电穿孔事件。在一些实施例中，在该一个电穿孔事件中将第二RNP复合物和第三RNP复合物引入到激活的T细胞中。在一些实施例中，第二RNP复合物中的第二Cas9酶的量与第三RNA复合物中的第三Cas9酶的量相同。在一些实施例中，第二Cas9酶的浓度为约0.3mg/mL，第三Cas9酶的浓度为约0.3mg/mL，靶向TRAC基因的第二gRNA的浓度为约0.08mg/mL，并且靶向β2M基因的第三gRNA的浓度为约0.2mg/mL。在一些实施例中，步骤(iii)中的细胞浓度为约100x106个细胞/mL至约400x106个细胞/mL。在一些实施例中，步骤(iii)中的细胞浓度为约300x106个细胞/mL。在其他实施例中，步骤(iii)(例如，电穿孔)中使用的每个容器中的总细胞数可为约5x108至约2.5x109个细胞，例如约7x108个细胞。在一些实例中，可在步骤(iii)(例如，电穿孔)中使用多个容器，例如约5至10个容器。在具体实例中，可在步骤(iii)中使用多达7个容器，这些容器可含有例如用于电穿孔的约1.5x109至约3x109个细胞(例如，约2.1x109个细胞或约2.7x109个细胞)。
[0010]在一些实施例中，AAV载体具有约10,000至约80,000的感染复数(MOI)值。在一些实施例中，AAV载体的MOI为约20,000。在一些实施例中，AAV载体是AAV血清型6(AAV6)载体。
[0011]在一些实施例中，通过在细胞培养容器中以约2x105个细胞/cm2至约5x105个细胞/cm2的接种密度培养第四T细胞群体约7天至约12天来进行步骤(v)。在一些实施例中，可将第四T细胞群体以约150,000个细胞/cm2至约600,000个细胞/cm2的接种密度接种于细胞培养容器中。在一些实施例中，以约3x105个细胞/cm2至约5x105个细胞/cm2的接种密度培养第四T细胞群体。在一些实施例中，细胞培养容器是在不更换培养基的情况下允许细胞扩增约10天至约12天的静态本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于生产基因工程化T细胞的方法，该方法包括：(i)提供第一T细胞群体；(ii)向该第一T细胞群体中引入包含第一Cas9酶和靶向CD70基因的第一引导RNA(gRNA)的第一核糖核蛋白(RNP)复合物以产生第二T细胞群体，其中该第二T细胞群体包含具有破坏的该CD70基因的T细胞；(iii)向该第二T细胞群体中引入包含第二Cas9酶和靶向T细胞受体α链恒定区(TRAC)基因的第二gRNA的第二RNP复合物以及包含第三Cas9酶和靶向β
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2微球蛋白(β2M)基因的第三gRNA的第三RNP复合物以产生第三T细胞群体，其中该第三T细胞群体包含具有破坏的该CD70基因、破坏的该TRAC基因和破坏的该β2M基因的T细胞；(iv)将该第三T细胞群体与腺相关病毒(AAV)载体一起温育以产生第四T细胞群体，其中该AAV载体包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列并且其中该核酸序列的两侧有该TRAC基因的同源序列，并且其中该第四T细胞群体包含表达该CAR并具有破坏的该CD70基因、破坏的该TRAC基因和破坏的该β2M基因的激活的T细胞；(v)扩增该第四T细胞群体，从而产生扩增的T细胞群体；(vi)从该扩增的T细胞群体中去除TCRαβ
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T细胞以产生基因工程化T细胞群体，其中该基因工程化T细胞群体包含表达该CAR并具有破坏的该CD70基因、破坏的该TRAC基因和破坏的该β2M基因的T细胞；以及(vii)收获该基因工程化T细胞群体。2.如权利要求1所述的方法，其中该第一T细胞群体来源于从人血细胞富集的冻存的T细胞。3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该第一T细胞群体通过包括以下步骤的过程制备：(a)从人类供体获得血细胞；以及(b)从这些血细胞富集CD4
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T细胞和/或CD8
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T细胞。4.如权利要求3所述的方法，其中使用与抗CD4和/或抗CD8抗体缀合的磁珠进行步骤(b)。5.如权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中该第一T细胞群体具有至少约80％的细胞活力和/或至少约80％的CD4
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和CD8
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T细胞的纯度。6.如权利要求3
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5中任一项所述的方法，该方法进一步包括(c)冻存步骤(b)中产生的这些富集的CD4
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T细胞和CD8
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T细胞。7.如权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中通过电穿孔进行步骤(ii)。8.如权利要求7所述的方法，其中该第一Cas9酶的浓度为约0.15mg/mL并且靶向该CD70基因的该第一gRNA的浓度为约0.16mg/mL。9.如权利要求7或权利要求8所述的方法，其中步骤(ii)中的细胞浓度为约100x106个细胞/mL至约350x106个细胞/mL。10.如权利要求9所述的方法，其中步骤(ii)中的细胞浓度为约300x106个细胞/mL。11.如权利要求1
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10中任一项所述的方法，其中该扩增步骤包括将这些T细胞以约150,000个细胞/cm2与约600,000个细胞/cm2之间、任选地约300,000个细胞/cm2与约500,000个细胞/cm2之间的密度接种于细胞容器中。12.如权利要求1
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11中任一项所述的方法，该方法进一步包括在步骤(ii)之后且在步
骤(iii)之前，在细胞培养容器中在存在T细胞激活剂的情况下温育该第二T细胞群体以产生激活的T细胞群体，其中该激活的T细胞群体包含具有破坏的该CD70基因的激活的T细胞。13.如权利要求12所述的方法，其中该T细胞激活剂包括CD3激动剂和CD28激动剂，并且其中该CD3激动剂和CD28激动剂附着于纳米基质颗粒。14.如权利要求12所述的方法，其中在细胞培养容器中在存在T细胞激活剂的情况下温育该第二T细胞群体是在约2x106/cm2的细胞接种密度和约2x106个细胞/mL的细胞浓度下进行约72小时。15.如权利要求12
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14中任一项所述的方法，其中该混合物中该T细胞激活剂与培养基的比率为约1:12.5(v/v)。16.如权利要求12
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15中任一项所述的方法，该方法进一步包括在存在T细胞激活剂的情况下温育该第二T细胞群体后，稀释该激活的T细胞群体中的该T细胞激活剂以减少激活并允许细胞在步骤(iii)之前恢复。17.如权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中通过电穿孔进行步骤(iii)。18.如权利要求1
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17中任一项所述的方法，其中步骤(iii)涉及一个电穿孔事件。19.如权利要求12
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16中任一项所述的方法，其中在该一个电穿孔事件中将该第二RNP复合物和该第三RNP复合物引...

【专利技术属性】
技术研发人员：J卡森，D卡莱齐迪斯，S谭，于慧，
申请(专利权)人：克里斯珀医疗股份公司，
类型：发明
国别省市：