一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法，包括如下步骤：向GT

【技术实现步骤摘要】
一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法


[0001]本专利技术涉及NK细胞扩增
，尤其涉及一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法。

技术介绍

[0002]肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗法。近年来自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)免疫治疗技术在世界范围内正在成为一种可靠的抗癌疗法，适用于多种恶性肿瘤的临床治疗且副作用小，不损伤正常组织。
[0003]NK细胞除对靶细胞具有溶解杀伤作用外，NK细胞还在机体免疫反应中具有重要功能。NK细胞可通过对MФ、粒细胞、树突状细胞的调节作用而控制天然免疫力。NK细胞可以作用于CD4+T细胞和CD8+T细胞以强化获得性免疫。
[0004]文献(朱敬,两种中草药提取物调控结肠癌细胞自噬的作用及机制研究:[D],北京工业大学,2020.06.01)公开了紫草中紫草素通过下调YAP参与调节结肠癌细胞的侵袭与自噬，明确了紫草素在预防与治疗结肠癌的可能机制。
[0005]目前，NK扩增的主要方法为单纯细胞因子刺激扩增法，其扩增效率及纯度较低，同时存在重复性差的缺点，目前还未发现采用紫草提取物对NK扩增，并提高扩增效率与纯度的研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法。
[0007]一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法，包括如下步骤：
[0008]S1、向GT
‑
T551H3培养液中添加自体血浆、150r/>‑
250IU/mL IL
‑
2、1
‑
5μg/mL紫草提取物得到培养基组A；
[0009]向GT
‑
T551H3培养液中添加自体血浆、150
‑
250IU/mL IL
‑
2、10
‑
30ng/mL IL
‑
15、50
‑
100ng/mL IL
‑
21、1
‑
5μg/mL紫草提取物，得到培养基组B；
[0010]S2、从外周血或脐带血中分离单个核细胞；将单个核细胞悬浮于培养基组A中培养3天，细胞浓度为2
‑4×
106/mL，补加培养基组A，继续培养至第7天；然后补加培养基组B，连续培养至第14天，培养过程中每隔一天补加培养基组B，得到扩增的NK细胞。
[0011]优选地，S1中，自体血浆在培养基组A所占体积分数为1
‑
10％。
[0012]优选地，S1中，自体血浆在培养基组B所占体积分数为1
‑
10％。
[0013]优选地，S1的培养基组A中，IL
‑
2浓度为180
‑
220IU/mL，紫草提取物的浓度为2
‑
4μg/mL。
[0014]优选地，S1的培养基组B中，IL
‑
2浓度为180
‑
220IU/mL，IL
‑
15浓度为15
‑
25ng/mL，IL
‑
21浓度为60
‑
80ng/mL，紫草提取物浓度为2
‑
4μg/mL。
[0015]优选地，S1中，紫草提取物采用如下具体操作制取：将将紫草加入至乙醇水溶液浸
泡20
‑
26h后，加热回流提取2
‑
3次，每次40
‑
60min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干得到紫草提取物。
[0016]优选地，S2中，将单个核细胞悬浮于培养基组A中置于培养培养箱中3天，培养箱参数为：温度37℃、6
‑
10％二氧化碳。
[0017]紫草提取物中含有：乙酰紫草素、β
‑
羟基异戊酰紫草素、紫草素、β,β
’‑
二甲基丙烯酰紫草素等。具有凉血，活血，解毒透疹的功能。用于血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤。
[0018]紫草素，是一种存在于紫草根中的萘醌类化合物，有研究显示紫草素可以通过不同的分子机制抑制肝癌、宫颈癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的死亡。这些研究结果表明紫草素是一种很有潜力的、可以用于癌症治疗的天然中草药提取物。申请人通过对紫草进行提取，发现只要很低的剂量即能明显促进人NK细胞增殖，提高NK细胞的杀瘤活性。
[0019]本专利技术的技术效果如下所示：
[0020](1)本专利技术以脐血或自体外周血为细胞来源，培养过程中无需滋养细胞，扩增效率高，所得NK细胞的纯度高。
[0021](2)本专利技术向培养基组A中添加IL
‑
2并与紫草提取物复配，通过体外培养条件下获得纯度较高的以及杀伤活性强的NK细胞，且应用安全性高；培养基组B中，进一步与IL
‑
2、IL
‑
15、IL
‑
21配合，经过扩增后，扩增倍数可达1200倍，且经流式细胞仪检测，NK细胞纯度在90％以上，并且本专利技术对不同的人体血液都有相同的结果，稳定性很好，
[0022](3)本专利技术方法简单、高效、有利于规模化生产。
附图说明
[0023]图1为实施例5和对比例的扩增倍数对比图。
[0024]图2为实施例5扩增方法培养14天的NK细胞稀释120倍后的照片及分析结果图。
[0025]图3为实施例5的细胞流式散点图。
[0026]图4为实施例5和对比例的纯度对比图。
[0027]图5为实施例5和对比例对K562细胞杀伤活性的对比图。
具体实施方式
[0028]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步解说。
[0029]实施例1
[0030]一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法，包括如下步骤：
[0031]S1、向GT
‑
T551H3培养液中添加自体血浆、150IU/mL IL
‑
2、1μg/mL紫草提取物得到培养基组A，自体血浆在培养基组A所占体积分数为1％；
[0032]向GT
‑
T551H3培养液中添加自体血浆、150IU/mL IL
‑
2、10ng/mL IL
‑
15、50ng/mL IL
‑
21、1μg/mL紫草提取物，得到培养基组B，自体血浆在培养基组B所占体积分数为1％；
[0033]紫草提取物采用如下具体操作制取：将5份将紫草加入至50份质量分数为50％的乙醇水溶液浸泡20h后，加热回流提取2次，每次40min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干得到紫草提取物；
[0034]S2、从外周血或脐带血中分离单个核细胞；将单个核细胞悬浮于培养基组A中在温度37℃、6％二氧化碳的培养箱中培养3天，细胞浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、向GT
‑
T551H3培养液中添加自体血浆、150
‑
250IU/mL IL
‑
2、1
‑
5μg/mL紫草提取物得到培养基组A；向GT
‑
T551H3培养液中添加自体血浆、150
‑
250IU/mL IL
‑
2、10
‑
30ng/mL IL
‑
15、50
‑
100ng/mL IL
‑
21、1
‑
5μg/mL紫草提取物，得到培养基组B；S2、从外周血或脐带血中分离单个核细胞；将单个核细胞悬浮于培养基组A中培养3天，细胞浓度为2
‑4×
106/mL，补加培养基组A，继续培养至第7天；然后补加培养基组B，连续培养至第14天，培养过程中每隔一天补加培养基组B，得到扩增的NK细胞。2.根据权利要求1所述NK细胞的高纯度高效率扩增方法，其特征在于，S1中，自体血浆在培养基组A所占体积分数为1
‑
10％。3.根据权利要求1所述NK细胞的高纯度高效率扩增方法，其特征在于，S1中，自体血浆在培养基组B所占体积分数为1
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：俞英豪，彭昉，王冶陶，洪茜茜，王朝芳，
申请(专利权)人：杭州中赢生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：