本发明专利技术提供一种靶向癌胚抗原的单域抗体、构建方法及其应用，所述单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1～11所示的其中一种。本发明专利技术采用健康羊驼作为获取抗体的实验动物，经过免疫后获取羊驼外周血，并判定抗体的效价。将抗体基因片段构建至噬菌体展示载体上，进行电转收集噬菌体展示库，并利用抗体库能够对特异性抗体进行筛选的特性，对免疫羊驼后得到的抗体进行筛选，获得多个与癌胚抗原结合及可溶表达的抗体。通过细胞筛选，得到亲和力较好的可作为靶点的序列用于构建能靶向CEA的纳米抗体，并可应用于结直肠癌的临床诊断和治疗。
1、噬菌体抗体展示技术是基于抗原抗体亲和力，以噬菌体表面为媒介的最常用的展示和筛选的基因工程技术。常用的噬菌体展示技术以m13、t4、t7、qβ和ms2噬菌体等为载体，从而将编码各种抗体的核酸序列整合到噬菌体的基因组，与编码噬菌体外壳蛋白的基因进行融合。然而，噬菌体展示过程需要经过细菌转化、噬菌体包装，抗体在细胞内的不同结合特性，导致噬菌体展示系统的文库容量和多样性受到限制。根据不同的靶抗体，对噬菌体进行修饰，构建库容量大、灵活性强的展示库，能够解决噬菌体展示系统的库容量和多样性问题。噬菌体抗体展示技术正在成为生物医学领域的重要工具，并在开发用于癌症或传染病诊断的显像剂方面的应用范围不断扩大。综上所述，随着技术的不断发展和完善，噬菌体展示技术的潜在应用价值可能会进一步增加。
2、结直肠癌(crc)是全球癌症死亡的主要原因，转移是结直肠癌癌症相关死亡的主要原因。转移性结直肠癌的治疗进展甚微。设计靶向和有效的治疗方法仍然是结直肠癌治疗的未满足的主要临床需求。癌胚抗原(cea)是一种在大多数结直肠肿瘤中过表达的糖蛋白，因此，对于癌胚抗原阳性的肿瘤疾病，可通过靶向癌胚抗原抗体作为检测或治疗药物，可用于产生新的靶向癌胚抗原治疗结直肠癌的治疗策略。目前关于靶向癌胚抗原的抗体药物尚无报道。因此，本专利技术提供一种靶向癌胚抗原的单域抗体，能够与可用与癌胚抗原特异性结合，可用于结直肠癌等恶性肿瘤的治疗。
/>技术实现思路
0、
技术实现思路
：
1、本专利技术的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种靶向癌胚抗原的单域抗体、构建方法及其应用，通过噬菌体展示技术筛选出能够与癌胚抗原(cea)特异性结合的sdab序列并挑选其中特异性强的序列进行载体构建及真核表达，从而获得亲和力高的抗体。这些对cea具有高度靶向性的抗体可应用于结直肠癌的临床诊断和治疗。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、(一)本专利技术提供一种靶向癌胚抗原的单域抗体，所述单域抗体的氨基酸序列为seq id no:1～11所示的其中一种。
4、进一步的，所述单域抗体的氨基酸序列为seq id no:1～2、seq id no:4～5、seqid no:8～9以及seq id no:11所示的其中一种。
5、进一步的，所述单域抗体为骆驼源的vhh。
6、(二)本专利技术提供以上所述的靶向癌胚抗原的单域抗体的构建方法，包括：
7、s1、取免疫羊驼外周血，提取外周血淋巴细胞rna，反转录扩增cdna；
8、s2、以cdna为模板，扩增羊驼抗体vhh基因片段，将vhh基因片段与载体连接，得到重组噬菌体载体；
9、s3、通过重组噬菌体载体构建单域抗体噬菌体文库；
10、s4、通过癌胚抗原对所述单域抗体噬菌体文库进行淘选，得到抗cea的阳性噬菌体。
11、进一步的，所述步骤s1中，羊驼免疫的方法为：
12、s1.1、初次免疫前采血留作阴性血清；
13、s1.2、将完全弗氏佐剂与癌胚抗原混合乳化后对羊驼进行注射，进行初次免疫，并检测免疫效价；
14、s1.3、将不完全弗氏佐剂与癌胚抗原混合乳化后对羊驼进行注射，进行若干次加强免疫，加强免疫间隔为两周，加强免疫后一周检测血清效价。
15、进一步的，所述步骤s2中，构建单域抗体噬菌体文库的方法为：
16、s2.1、以cdna为模板，通过巢式pcr扩增方法扩增vhh基因片段；
17、s2.2、通过限制性内切酶酶切连接方法，将vhh基因片段与m13噬菌体展示载体质粒连接，电转化至感受态细胞中，得到单域抗体噬菌体文库。
18、进一步的，所述s4中，噬菌体文库进行淘选后，对抗cea的阳性噬菌体进行筛选，得到与癌胚抗原亲和力高的靶向癌胚抗原的单域抗体，筛选方法为：将筛选的阳性克隆通过噬菌体展示方法表达抗体，使用elisa方法鉴定上述阳性克隆与癌胚抗原的亲和力，筛选与癌胚抗原亲和力高的阳性克隆，并进行序列分析，得到靶向癌胚抗原的单域抗体。
19、(三)本专利技术还提供以上所述的靶向癌胚抗原的单域抗体在制备癌胚抗原检测试剂中的应用。
20、(四)本专利技术还提供以上所述的靶向癌胚抗原的单域抗体在制备癌胚抗原阳性肿瘤如结直肠癌治疗药物中的应用。
21、(五)本专利技术提供一种核酸，编码以上所述的靶向癌胚抗原的单域抗体。
22、(六)本专利技术还提供以上所述的核酸在制备针对癌胚抗原阳性肿瘤的基因治疗药物中的应用。
23、本专利技术的有益效果：
24、本专利技术基于噬菌体展示技术，采用健康羊驼作为获取抗体的实验动物，经过免疫后获取羊驼外周血，并判定抗体的效价。将抗体基因片段构建至噬菌体展示载体上，进行电转收集噬菌体展示库，并利用抗体库能够对特异性抗体进行筛选的特性，对免疫羊驼后得到的抗体进行筛选，获得多个与癌胚抗原结合及可溶表达的抗体。通过细胞筛选，得到亲和力较好的可作为靶点的序列用于构建能靶向癌胚抗原的纳米抗体，可应用于结直肠癌的临床诊断和治疗。本专利技术为结直肠肿瘤的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药，同时可为结直肠肿瘤的诊断提供相应的检测试剂。
本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向癌胚抗原的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体的氨基酸序列为SEQ IDNO:1～11所示的其中一种。
2.根据权利要求1所述的靶向癌胚抗原的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:4～5、SEQ ID NO:8～9以及SEQ ID NO:11所示的其中一种。
3.权利要求1～2任意一项所述的靶向癌胚抗原的单域抗体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的靶向癌胚抗原的单域抗体的构建方法，其特征在于：
5.根据权利要求3所述的靶向癌胚抗原的单域抗体的构建方法，其特征在于：
6.根据权利要求3所述的靶向癌胚抗原的单域抗体的构建方法，其特征在于：
7.权利要求1～2任意一项所述的靶向癌胚抗原的单域抗体在制备癌胚抗原检测试剂中的应用。
8.权利要求1～2任意一项所述的靶向癌胚抗原的单域抗体在制备癌胚抗原阳性肿瘤治疗药物中的应用。
9.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1～2任意一项所述的靶向癌胚抗原的单域抗体。
10.权利要求9所述的核酸在制备针对癌胚抗原阳性肿瘤的基因治疗药物中的应用。
...
【技术特征摘要】
1.一种靶向癌胚抗原的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体的氨基酸序列为seq idno:1～11所示的其中一种。
2.根据权利要求1所述的靶向癌胚抗原的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体的氨基酸序列为seq id no:1～2、seq id no:4～5、seq id no:8～9以及seq id no:11所示的其中一种。
3.权利要求1～2任意一项所述的靶向癌胚抗原的单域抗体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的靶向癌胚抗原的单域抗体的构建方法，其特征在于：
5....
【专利技术属性】
技术研发人员：冯敏，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。