一种共济失调动物模型的构建方法以及应用技术

本发明专利技术公开了一种共济失调动物模型的构建方法以及应用，涉及医学工程技术领域。本发明专利技术公开的共济失调动物模型的构建方法，其包括敲除目标动物的小脑浦肯野细胞中的基因组上的目的序列；所述目的序列为Tmem30a基因。该方法首次通过特异性敲除目标动物的小脑浦肯野细胞中的基因组上的Tmem30a基因序列，可以构建出小脑共济失调的动物模型，该动物模型表现出小脑共济失调的典型特征：步态不稳，小脑萎缩，浦肯野细胞进行性凋亡等。该模型可用于小脑共济失调的研究，为小脑共济失调的致病基因的发现和致病机理的探索提供基础。

The construction of an ataxia animal model and its application

The invention discloses a method for constructing an ataxia animal model and its application, which relates to the technical field of medical engineering. The invention discloses a method for constructing ataxia animal models, which includes knocking out the target sequence on the genome of cerebellar Purkinje cells in target animals, and the target sequence is Tmem30a gene. The method for the first time through the sequence of Tmem30a gene knock-out animal cerebellar Purkinje cells in the genome, can construct the animal model of cerebellar ataxia, the animal model showed typical features of cerebellar ataxia: gait instability, cerebellar atrophy, Purkinje cells of apoptosis. This model can be used for the study of cerebellar ataxia, which provides a basis for the discovery of the pathogenetic genes and the pathogenesis of cerebellar ataxia.

【技术实现步骤摘要】
一种共济失调动物模型的构建方法以及应用
本专利技术涉及医学工程
，具体而言，涉及一种共济失调动物模型的构建方法以及应用。
技术介绍
共济失调(Ataxia)是患者不能按一定的形式维持精细步态、完成精确动作的一种病理状态，任何涉及小脑传入或传出途径的病变都可能导致共济失调。其中多数由遗传因素所致,故统称为遗传性共济失调(Hereditaryataxia，HA)。HA是一组以慢性进行性小脑性共济失调为特征的遗传变性病；世代相传的遗传背景、共济失调表现及小脑损害为主的病理改变是三大特征。遗传性共济失调分类尚不明晰，至今报道的已有60多种，但尚无统一和公认的分类方法。根据其病发部位可分为四种类型：①深感觉障碍共济失调；②小脑共济失调；③前庭迷路共济失调；④大脑型共济失调。小脑共济失调是遗传性共济失调主要类型，是—大类具有明显遗传异质性的神经系统变性疾病，主要症状为步态不稳，肢体无力，以小脑症状为突出特点，并伴有认知障碍。小脑共济失调遗传模式多样，包括常染色体显性、隐性遗传，X-连锁遗传等多种遗传模式，还包括一些散发病例。目前已发现了30余种小脑共济失调亚型，约占神经系统遗传性疾病的10％～15％。小脑共济失调的临床症状复杂、交错重叠，即使同一家族也可表现高度异质性。并且其临床累及面广，各型之间临床表型存在较大的重叠，临床分型非常困难，因此最终诊断小脑共济失调必须依靠基因检测。但因其分型众多，致病基因繁冗复杂，为诊断带来极大困难。此外，目前临床上尚无针对小脑共济失调具体有效的治疗方法，其主要原因就是缺乏详细的发病机理研究。而未来对于小脑共济失调的诊断和治疗还要依赖于目前对其致病基因的发现和致病机理的研究。而目前，缺乏相关的可用于共济失调研究的动物模型。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种共济失调动物模型的构建方法，该构建方法可以构建在小脑浦肯野细胞中特异敲除Tmem30a的小脑共济失调动物模型，以便研究其在小脑浦肯野细胞中的功能。本专利技术的另一目的在于提供一种由上述构建方法得到的共济失调动物模型在共济失调研究中的应用。本专利技术是这样实现的：一种共济失调动物模型的构建方法，敲除目标动物的小脑浦肯野细胞中的基因组上的目的序列；所述目的序列为Tmem30a基因。由上述的共济失调动物模型的构建方法所得到的共济失调动物模型在共济失调研究中的应用。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的共济失调动物模型的构建方法，首次通过特异性敲除目标动物的小脑浦肯野细胞中的基因组上的Tmem30a基因序列，可以构建出小脑共济失调的动物模型，该动物模型表现出小脑共济失调的典型特征：步态不稳，小脑萎缩，浦肯野细胞进行性凋亡等。该模型可用于小脑共济失调的研究，为小脑共济失调的致病基因的发现和致病机理的探索提供基础。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实施例提供的小脑浦肯野细胞Tmem30a特异模型构建路线和敲除小鼠基因型鉴定图；图2为本专利技术实施例提供的小脑浦肯野细胞中TdTomato报告基因构建示意图(图中tdTomato是一个转基因红色荧光蛋白Tomato报告基因，在红色荧光蛋白的初始密码子前面有终止子序列；终止子两端带有同向排列的LoxP位点，在有Cre酶表达的时候终止子会被删除，红色荧光蛋白可以表达，Cre阳性细胞被标记惟红色)；图3为本专利技术实施例提供的免疫荧光染色(Immunohistochemistry,IHC)表明Pcp2-Cre特异表达于小鼠小脑浦肯野细胞(图中：GCL:Granularcelllayer，颗粒细胞层；PCL：Purkinjecelllayer，浦肯野细胞层；ML：Molecularlayer，分子层；Calbindin是表达于小脑浦肯野细胞中的标记蛋白)；图4为本专利技术实施例提供的免疫印迹(Westernblot，WB)法验证Tmem30a蛋白在敲除小鼠小脑中表达量降低(图中：WT:Wildtype，野生型对照；KO：Knockout，基因敲除突变；Cerebrum,大脑；Cerebellum,小脑)；图5为本专利技术实施例提供的浦肯野细胞特异敲除Tmem30aKO小鼠提起尾部时后肢蜷缩的照片图(6mo是指6个月龄)；图6为本专利技术实施例提供的Tmem30aKO小鼠的小脑萎缩照片图；10mo是指10个月龄)；图7为本专利技术实施例提供的石蜡切片染色结果；图8为本专利技术实施例提供的Tmem30aKO小鼠小脑浦肯野细胞进行性减少；图9为本专利技术实施例提供的Tmem30aKO小脑中内质网应激标志蛋白Chop和PDI的免疫组化染色图。图中A是Tmem30aKO小脑切片中中内质网应激标志蛋白C/EBPhomologousprotein(CHOP)表达情况，箭头指示出现内质网应激的细胞，可以看出Tmem30aKO小脑中CHOP蛋白表达细胞明显增加。图中B是Tmem30aKO小脑切片中中内质网应激标志蛋白ProteinDisulfideIsomerase(PDI)表达情况，箭头指示出现内质网应激的细胞，可以看出Tmem30aKO小脑中PDI表达细胞明显增加。图中C是A，B表达水平的量化。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例的共济失调动物模型的构建方法以及应用进行具体说明。小脑共济失调的典型神经病理学改变是小脑萎缩，浦肯野细胞的退行性病变和丢失。浦肯野细胞(Purkinjecell，PC)是从小脑皮质发出的唯一能够传出冲动的神经元。PC轴突穿过颗粒层和白质到达深部小脑核团，PC在运动协调中起着重要的作用。ATP8A2(一种P4-ATP酶)的基因突变能够导致小脑功能异常，患者表现出小脑共济失调的症状，表明P4-ATP酶的活性与小脑共济失调息息相关。P4-ATP酶是细胞膜上一种具有磷脂内翻活性的酶，故又称为磷脂内翻酶，它对于维持膜两侧的磷脂不对称分布非常重要，膜两侧磷脂不对称分布对于维持质膜微环境稳定，膜蛋白功能发挥，细胞囊泡转运，细胞极性，细胞凋亡等至关重要。其中一些磷脂分布集中在细胞质一侧，例如PE和PS，这种不对称分布就取决于膜上P4-ATP酶的活性。哺乳动物基因组编码14种不同的P4-ATP酶，P4-ATP酶的缺陷可导致多种疾病，说明其在体内的功能至关重要。Cdc50家族(Cdc50a，b，c，也称为Tmem30a，b，c)能够和P4-ATP酶相互作用，并且对于P4-ATP酶的正确折叠和亚细胞定位是必须的，因此被认为是P4-ATP酶的β亚基。由于P4-ATP酶在动物体内有14种，在组织中功能冗余，相互交叉影响，不易研究其功能。而其β亚基只有三个，并且绝大多数P4-ATP酶与Tmem30a相互作用，因此想要研究P4-ATP酶的功能，阐明其导致小脑共济失调本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种共济失调动物模型的构建方法，其特征在于，敲除目标动物的小脑浦肯野细胞中的基因组上的目的序列；所述目的序列为Tmem30a基因。

【技术特征摘要】
1.一种共济失调动物模型的构建方法，其特征在于，敲除目标动物的小脑浦肯野细胞中的基因组上的目的序列；所述目的序列为Tmem30a基因。2.根据权利要求1所述的共济失调动物模型的构建方法，其特征在于，所述目的序列为Tmem30a基因上的外显子序列。3.根据权利要求2所述的共济失调动物模型的构建方法，其特征在于，所述目标动物选自小鼠、大鼠、狗、猴以及猿中的任意一种。4.根据权利要求3所述的共济失...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱献军，鲁芳，杨业明，张琳，李姝锦，杨牧，张姗姗，
申请(专利权)人：四川省人民医院，
类型：发明
国别省市：四川,51