一种制备CD13基因敲除的猪成纤维细胞和基因编辑猪的方法技术

本发明专利技术提供了一种基因敲除载体、制备CD13基因敲除的猪成纤维细胞或基因编辑猪的方法、由上述方法制备而成的CD13敲除的猪成纤维细胞。本发明专利技术所述基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述载体骨架选自CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑3任一项所示，优选地，如SEQ ID NO：1所示。通过本发明专利技术上述载体和方法可以快速、准确地将CD13基因敲除，获得CD13基因纯合敲除、且不带有外源标记基因的猪成纤维细胞或基因编辑猪，可以为猪流行性腹泻提供研究平台，同时具有极高的抗病育种价值。

A method of producing CD13 gene knockout pig fibroblasts and gene editing pigs

The invention provides a gene knockout vector, a method for preparing CD13 knockout pig fibroblast or a gene editing pig, and a CD13 knockout porcine fibroblast prepared by the above method. The gene knockout vector including gene editing vector backbone and connected to a DNA fragment of the carrier frame, wherein the carrier is selected from CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas9n, CRISPR/Cpf1 framework or CRISPR/C2c2, the nucleotide sequence of the DNA fragment of the 3 as a show, such as SEQ ID NO:1 preferably, such as SEQ ID NO:1 shown. The invention of the carrier and method can quickly and accurately obtain the CD13 gene knockout, CD13 homozygous knockout, and not with exogenous marker gene of porcine fibroblasts or pig gene editing, can provide a research platform for porcine epidemic diarrhea, resistance breeding and has a very high value.

【技术实现步骤摘要】
一种制备CD13基因敲除的猪成纤维细胞和基因编辑猪的方法
本专利技术涉及基因编辑领域，具体而言，涉及一种制备CD13基因敲除的猪成纤维细胞和基因编辑猪的方法。
技术介绍
猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，PED)是一种由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的高度传染性肠道疾病。任何年龄的猪均可感染，对仔猪影响尤其严重，病死率非常高，特别对于7日龄内的新生仔猪，在缺乏有效母源抗体下，死亡率可高达100％；对成年的怀孕母猪来说，感染后繁殖性能受到影响，如怀孕早期的母猪感染后会出现流产，受孕率降低；育肥猪感染后体重下降。目前，虽然有商品化猪流行性腹泻病毒疫苗，猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎(TGEV)的二联苗已普遍使用，但该病仍然很流行。2007年，泰国暴发了猪流行性腹泻，大批的仔猪发生死亡，造成严重经济损失。2010年底，我国养猪场大范围爆发了猪流行性腹泻，且近年来仍未得到有效控制，对我国养猪业造成了巨大的损失。2013年4月美洲国家陆续爆发猪流行性腹泻疫情，随后亚洲其他国家和部分欧洲国家也相继爆发猪流行性腹泻病毒疫情，再次给世界范围内的养猪业带来了巨大的危害。由PEDV引起的猪流行性腹泻给养猪产业造成巨大的经济损失。猪氨肽酶(pAPN)是Pfleiderer和Celliers从猪的肾脏中分离得到猪氨肽酶N(Pfleiderer&Celliers1963)，其酶活性表现为从小肽段N端切除氨基酸，因此命名为氨肽酶N。之后，根据cDNA克隆序列对比确定了APN即为细胞表面的促分化抗原CD13。最近研究发现，CD13为PEDV的受体，PEDV主要通过与猪小肠黏膜上皮细胞中的CD13结合感染仔猪。CD13作为PEDV侵入细胞的必要结合受体意义重大，这为抗流行性腹泻病毒猪的新品种培育提供新思路，即通过敲除猪的CD13基因来阻止PEDV对猪的感染，能够为猪流行性腹泻的研究提供重要平台，且在培育具有抗流行性腹泻病毒的猪方面具有重要意义。因此，建立一种可以快速、准确、有效地敲除猪CD13基因的方法对本领域而言至关重要。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种基因敲除载体，通过所述载体可以简单、快速、高效地定点敲除CD13基因。本专利技术的第二目的在于提供一种制备CD13基因敲除的猪成纤维细胞的方法，通过所述方法可以简单、快速、高效地获得CD13基因纯合敲除且不携带任何外源标记的猪成纤维细胞，对研究猪流行性腹泻以及猪的抗病育种具有重要意义。本专利技术的第三目的在于提供根据上述方法制备而成的CD13基因敲除的猪成纤维细胞，所述猪成纤维细胞纯合敲除CD13基因且不携带外源标记，对研究猪流行性腹泻以及猪的抗病育种具有重要意义。本专利技术的第四目的在于提供一种制备CD13基因敲除的基因编辑猪的方法，通过该方法可以简单、高效地获得CD13基因纯合敲除的基因编辑猪，对研究猪流行性腹泻以及猪的抗病育种具有重要意义。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种基因敲除载体，所述基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述载体骨架选自CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO：1-3任一项所示，优选地，如SEQIDNO：1所示。传统的基因敲除系统主要以ZFN和TALEN技术为基础，需要通过复杂的操作以及花费大量精力才能将靶基因敲除。而本专利技术上述基因敲除载体属于CRISPR基因编辑系统，利用CRISPR技术对靶基因进行定点敲除，从整体上极大地降低了基因敲除的操作难度，提高了敲除的效率，并且不会引入外源标记基因，具有效率高、精确性高和操作简单的优势。另外一方面，本专利技术对基因敲除的靶序列gRNA进行了优化，从多条靶序列中获得敲除效率最高的靶序列，克服了CRISPR基因编辑系统在敲除过程中脱靶率高的缺陷，进一步提高打靶的效率，从而可以在短时间内快速地获得敲除靶基因的纯合子。在一些具体实施方式中，所述载体骨架为CRISPR/Cas9，优选地，所述CRISPR/Cas9选自pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551和pX552，更优选地，所述CRISPR/Cas9为pX330。本专利技术还涉及一种制备CD13基因敲除的猪成纤维细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(1)构建上述的基因敲除载体；(2)将所述基因敲除载体转入猪成纤维细胞，通过筛选和鉴定获得CD13基因纯合敲除的单克隆细胞。本专利技术上述方法以前述基因敲除载体为基础建立而成，通过所述方法可以简单、快速、高效地获得CD13基因纯合敲除且不携带任何外源标记的猪成纤维细胞，对研究猪流行性腹泻以及猪的抗病育种具有重要意义。在一些具体实施方式中，所述方法中的成纤维细胞为胎儿成纤维细胞。在一些具体实施方式中，所述步骤(1)具体包括：将互补的寡核苷酸单链退火形成双链，与经过酶切的载体骨架连接，经筛选和鉴定获得阳性克隆即得所述基因敲除载体，所述互补的寡核苷酸单链的序列如SEQIDNO：4-5所示，或SEQIDNO：6-7所示，或SEQIDNO：8-9所示。在一些具体实施方式中，所述步骤(2)具体包括：将基因敲除载体通过电转染的方式转入猪成纤维细胞，通过有限稀释法筛选单克隆细胞，并鉴定所述单克隆细胞是否为CD13基因纯合敲除的阳性单克隆细胞。在一些具体实施方式中，步骤(2)中所述鉴定具体包括：提取单克隆细胞的基因组DNA，使用如SEQIDNO：10-11所示引物进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序，根据测序结果判定所述单克隆细胞是否为CD13基因纯合敲除的阳性单克隆细胞；优选地，所述PCR扩增的退火温度为57～59℃，循环数为32～36，更优选地，所述PCR扩增的退火温度为58℃，循环数为34。本专利技术还涉及根据上述方法制备而成的CD13基因敲除的猪成纤维细胞。本专利技术上述猪成纤维细胞纯合地敲除CD13基因，且不携带外源标记基因，对研究猪流行性腹泻以及猪的抗病育种具有重要意义。本专利技术还涉及一种制备CD13基因敲除的基因编辑猪的方法，所述方法以上述猪成纤维细胞作为核移植供体细胞，将其细胞核移植入去核的卵母细胞，制备重组克隆胚胎并移植入母体内经妊娠获得CD13基因敲除的基因编辑猪。本专利技术上述方法以前述CD13基因敲除的猪成纤维细胞细胞为基础建立而成，通过所述方法可以快速、简单、高效地获得CD13纯合敲除的基因编辑猪，对研究猪流行性腹泻以及猪的抗病育种具有重要意义。在一些具体实施方式中，所述方法还包括对CD13基因敲除的基因编辑猪进行鉴定的步骤，所述鉴定的步骤包括：提取猪的基因组DNA，使用核苷酸序列如SEQIDNO：10-11所示的上下游引物对提取的DNA基因组进行扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳或测序，根据电泳或测序结果确定所述猪是否已经将CD13基因敲除，其中具体的PCR扩增条件为：退火温度为57～59℃，循环数为32～36，更优选地，所述退火温度为58℃，循环数为34。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术采本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因敲除载体，其特征在于，所述基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述载体骨架选自CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑3任一项所示，优选地，如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种基因敲除载体，其特征在于，所述基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述载体骨架选自CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO：1-3任一项所示，优选地，如SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的基因敲除载体，其特征在于，所述载体骨架为CRISPR/Cas9，优选地，所述CRISPR/Cas9选自pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551和pX552，更优选地，所述CRISPR/Cas9为pX330。3.一种制备CD13基因敲除的猪成纤维细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)构建权利要求1或2所述的基因敲除载体；(2)将所述基因敲除载体转入猪成纤维细胞，通过筛选和鉴定获得CD13基因纯合敲除的单克隆细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述猪成纤维细胞为胎儿成纤维细胞。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：将互补的寡核苷酸单链退火形成双链，与经过酶切的载体骨架连接，经筛选和鉴定获得阳性克隆即得所述基因敲除载体，所述互补的寡核苷酸单链的序列如SEQIDNO：4-5所示，或SEQIDNO：6-7所示，或SEQIDNO：8-9所示。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志国，牟玉莲，李奎，李巨浪，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11