The invention relates to the field of cell biology technology, in particular to an efficient method in vitro of neural stem cells obtained by CRISPR/Cas9, A, Pax6 system constructed with the GFP report system of embryonic stem cell lines; B, Pax6 GFP ES reporting system indicating the neural differentiation in vitro and in vivo; C, Pax6 GFP report system for the enrichment and purification of neural stem cells; the invention uses CRISPR/Cas9 gene editing tools with the construction of Pax6 GFP fluorescence reporter system of cells, and through the cells of neural stem cells in vitro to achieve rapid and efficient access.
【技术实现步骤摘要】
一种体外高效获得神经干细胞的方法
本专利技术涉及细胞生物学
,具体来说是一种体外高效获得神经干细胞的方法。
技术介绍
由于一些神经退行性疾病的病因是某些神经元的缺失,因此干细胞疗法对于治疗此类疾病有很大的潜在价值,神经干细胞就是其中不可或缺的一环。如何在体外快速获得神经干细胞是科学家们一直探讨的问题。现有体外分化神经干细胞的方法主要有三种:EB悬浮培养不定向分化到神经干细胞;胚胎干细胞与特定基质细胞共培养;在特定生长因子条件下单层贴壁培养。这三种方法有一个共同的缺点,即需要实验者的经验丰富,操作的主观性太强。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种体外高效获得神经干细胞的方法。为实现上述目的,本专利技术采用的技术方案是:一种体外高效获得神经干细胞的方法,包括如下步骤:A、通过CRISPR/Cas9系统构建拥有Pax6-GFP报告系统的胚胎干细胞细胞系;B、Pax6-GFPES报告系统在体外和体内指示神经分化;C、Pax6-GFP报告系统富集纯化神经干细胞。进一步的,所述步骤A具体包括:A1、设计供体质粒,包含左同源臂、增强型绿色荧光蛋白、由SV40启动子启动的新霉素抗性基因和右同源臂,并在增强型绿色荧光蛋白之前插入自剪接多肽,将整个元件插入到Pax6基因17号外显子后面,替换掉原有的终止密码子,使Pax6和增强型绿色荧光蛋白共表达(图1所示);A2、在pax6基因附近设计了两种sgRNA,以引起目标基因组的双链断裂,造成基因组上的缺口,便于供体质粒的整合;A3、在用Cas9-sgRNA质粒和供体质粒转染两天后,用流式细胞仪进行分选Cas9-GFP阳性细 ...
【技术保护点】
一种体外高效获得神经干细胞的方法,其特征在于,包括如下步骤:A、通过CRISPR/Cas9系统构建拥有Pax6‑GFP报告系统的胚胎干细胞细胞系;B、Pax6‑GFP ES报告系统在体外和体内指示神经分化;C、Pax6‑GFP报告系统富集纯化神经干细胞。
【技术特征摘要】
1.一种体外高效获得神经干细胞的方法,其特征在于,包括如下步骤:A、通过CRISPR/Cas9系统构建拥有Pax6-GFP报告系统的胚胎干细胞细胞系;B、Pax6-GFPES报告系统在体外和体内指示神经分化;C、Pax6-GFP报告系统富集纯化神经干细胞。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤A具体包括:A1、设计供体质粒,包含左同源臂、增强型绿色荧光蛋白、由SV40启动子启动的新霉素抗性基因和右同源臂,并在增强型绿色荧光蛋白之前插入自剪接多肽,将整个元件插入到Pax6基因17号外显子后面,替换掉原有的终止密码子,使Pax6和增强型绿色荧光蛋白共表达;A2、在pax6基因附近设计了两种sgRNA,以引起目标基因组的双链断裂,造成基因组上的缺口,便于供体质粒的整合;A3、在用Cas9-sgRNA质粒和供体质粒转染两天后,用流式细胞仪进行分选Cas9-GFP阳性细胞;A4、将分选得到的细胞进一步在含有G418的ESCs培养基中培养以选择抗性克隆,用3对引物通过PCR鉴定随机挑选的亚克隆,挑选纯合子作为拥有Pax6-GFP报告系统的纯合的ES细胞系,即6#细胞,命名Pax6GFP/GFP。3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤A1中,两种所述sgRNA为sgRNA1:CCCGGTGTGGATGCGGATAT;sgRNA2:AGGCCTCTTTTGGTATTCCA。4.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员:帅领,李艳妮,李旭,张文豪,王海松,
申请(专利权)人:南开大学,
类型:发明
国别省市:天津,12
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