一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法技术

本发明专利技术公开了一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法，属于基因敲除领域。该方法通过CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计，构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成，斑马鱼胚胎进行显微注射，检测靶位点的有效性，注射两个月之后，进行剪尾鉴定，对目的序列进行TA克隆，质粒进行Sanger测序获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代，从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交获得斑马鱼突变体的F2，从中挑选出F2代纯合子，进行F3代纯系遗传得到rmnd5b基因缺失型斑马鱼品系。本发明专利技术方法脱靶率较低，且研究rmnd5b基因的缺失与其他器官的发育的相关性，具有很好的医学研究价值。

A gene knockout method for breeding rmnd5b gene deficient zebrafish

The invention discloses a method for gene knockout and breeding of rmnd5b gene deficient zebrafish, which belongs to the field of gene knockout. This method was designed by CRISPR/Cas9 gene knockout target site, gRNA expression vector was constructed and gRNA was synthesized in vitro. Zebrafish embryos were microinjected to detect the effectiveness of target loci. After two months of injection, the tail was identified, TA cloned to the target sequence, and plasmid entered Sanger sequencing to obtain genetic zebrafish. The mutant F1 generation, selected the same mutant female and male from the F1 mutant, obtained the F2 of the zebrafish mutants, selected the F2 homozygote and inherited the rmnd5b gene deleted zebrafish strain from the F3 generation. The method has low miss rate and has good medical research value by studying the correlation between the deletion of rmnd5b gene and the development of other organs.

【技术实现步骤摘要】
一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法
本专利技术属于基因敲除领域，更具体地说，涉及一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法。
技术介绍
RMND5B(requiredformeioticnucleardivision5homologB)基因位于人类5q35.3，编码391个氨基酸。一般认为该基因在人类早期胚胎的多个组织中有表达，在心脏、肝和肾中的表达水平较强。通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析等，发现RMND5B基因与心脏早期发育密切相关。斑马鱼与人类在心脏发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且RMND5B基因进化上较为保守，人类RMND5B基因对应于斑马鱼rmnd5b基因，研究发现rmnd5b在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼个体小、幼鱼通体透明，利于心脏发育的观察。基因打靶技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要的方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用，所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC)和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，但同时该技术存在一定的缺陷，其脱靶率相对较高。
技术实现思路
针对现有基因打靶技术中存在的脱靶率相对较高问题，本专利技术提供了一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，脱靶率较低，且研究rmnd5b基因的缺失与其他器官的发育的相关性，具有很好的医学研究价值。解决上述技术问题的技术方案如下：A.CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计在NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)上查询斑马鱼rmnd5b基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站TheZiFiTTargeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT_Cas9)上设计一对rmnd5b基因的靶位点。靶点的选择必须遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时可以不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG。靶点的选择必须确保靶点位置碱基的插入或者缺失可以影响rmnd5b基因的整个结构域，从而改变基因的表达。两对特异性PCR引物如下：F1(靶位点a正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAgagtagttgctgagaatgtgtGTTTTAGAGCTAGAAATAGCF2(靶位点b正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAgtgttgcagaagacctctgccGTTTTAGAGCTAGAAATAGCR(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACTB.构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成(1)首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1-2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测；(2)特异性gRNA体外合成用BsaI限制性内切酶线性化此质粒。一般来说，酶切反应总体积为20μL，体系如下：离心混匀后于37℃水浴，酶切2h以上。(3)以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA。>PCR引物PCR引物上下游引物分别位于1号和3号内含子上：F(5’-GCCAGTGCTGCTGACATGACTAATA-3’)R(5’-GAACACAGACCCACAAGACACAAGT-3’)正向引物F：T7启动子_20bp靶序列_20bpgRNA上游骨架反向引物R：20bpgRNA下游骨架PCR反应体系(25μL)如下：震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为：预变性95℃8min，(变性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃20s)30个循环，再72℃8min。待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果(4)检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物。(5)测定纯化之后的DNA浓度(尽量达到1μg)，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA。转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下。体外转录反应体系(20μL)：将反应物都加入1.5mLRNase-Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴2h；水浴结束后，取1μL样品，用配制好的2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；向转录体系中加入1μLDNA酶，放置于37℃水浴锅中反应30min，用以消化DNA模板，再取1μL转录终产物，即gRNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录效率。(6)特异性gRNA的纯化用RNeasyMinikit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃。吸取1μL溶液进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度。C.斑马鱼胚胎的显微注射尽量在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中。在进行显微注射之前，将Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9mRNA的终浓度为300ng/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL。注射约1.8nLCas9mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内。注射过的受精卵放置于E3水(5mmol/LNaCl，0.33mmol/LCaCl2，0.33mmol/LMgSO4，0.19mmol/LKCl，)中，28℃孵化。在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析。显微注射体系如下：D、T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其rmnd5b基因是否存在突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范。提取斑马鱼基因组斑马鱼胚胎受精50小时后(50hpf)，分别收集野生型(做对照)和注射后胚胎于1.5mLEp管中(每管10只胚胎)，按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：向装有胚胎的Ep管中加入400μL细胞裂解液，2μL蛋白酶K，放置于55℃水浴锅中裂解2小时以上(期间每隔半小时，轻轻颠倒混匀，以保证胚胎被充分裂解完全)；裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括如下步骤：A.CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上查询斑马鱼rmnd5b基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站The ZiFiT Targeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT_Cas9)上设计一对rmnd5b基因的靶位点；两对特异性PCR引物如下：F1(靶位点a正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAgagtagttgctgagaatgtgtGTTTTAGAGCTAGAAATAGCF2(靶位点b正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAgtgttgcagaagacctctgccGTTTTAGAGCTAGAAATAGCR(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACTB.构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成(1)首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1‑2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测；(2)特异性gRNA体外合成；用BsaI限制性内切酶线性化此质粒，体系如下：...

【技术特征摘要】
1.一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括如下步骤：A.CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计在NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)上查询斑马鱼rmnd5b基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站TheZiFiTTargeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT_Cas9)上设计一对rmnd5b基因的靶位点；两对特异性PCR引物如下：F1(靶位点a正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAgagtagttgctgagaatgtgtGTTTTAGAGCTAGAAATAGCF2(靶位点b正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAgtgttgcagaagacctctgccGTTTTAGAGCTAGAAATAGCR(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACTB.构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成(1)首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1-2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测；(2)特异性gRNA体外合成；用BsaI限制性内切酶线性化此质粒，体系如下：离心混匀后于37℃水浴，酶切2h以上；(3)以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA；>PCR引物PCR引物上下游引物分别位于1号和3号内含子上：F(5’-GCCAGTGCTGCTGACATGACTAATA-3’)R(5’-GAACACAGACCCACAAGACACAAGT-3’)正向引物F：T7启动子_20bp靶序列_20bpgRNA上游骨架反向引物R：20bpgRNA下游骨架PCR反应体系(25μL)如下：震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应，待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果；(4)检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物；(5)测定纯化之后的DNA浓度(尽量达到1μg)，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA，转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下：体外转录反应体系(20μL)：将反应物都加入1.5mLRNase-Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴2h，水浴结束后，取1μL样品，用配制好的2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功，向转录体系中加入1μLDNA酶，放置于37℃水浴锅中反应30min，用以消化DNA模板，再取1μL转录终产物，即gRNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录效率；(6)特异性gRNA的纯化用RNeasyMinikit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃，吸取1μL溶液进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度；C.斑马鱼胚胎的显微注射尽量在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中，在进行显微注射之前，将Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9mRNA的终浓度为300ng/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL，注射约1.8nLCas9mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内，注射过的受精卵放置于E3水中，28℃孵化，在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；显微注射体系如下：D.T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其rmnd5b基因是否存在突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范；斑马鱼胚胎受精50小时后(50hpf)，分别收集野生型(做对照)和注射后胚胎于1.5mLEp管中(每管10只胚胎)，提取基因组DNA；PCR扩增目的序列提取基因组DNA之后，根据CRISPR靶位点上下游约150-200bp的基因组区域，利用PrimerPremier5.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段；PCR反应体系(50μL)如下：震荡混匀之后，4℃离心，于PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓云，潘琪，吴秀山，袁婺洲，欧阳诗，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43