木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系制造技术

本发明专利技术涉及木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系，属于生物技术领域。将XynB基因插入真核表达载体pcDNA3.1(-)，并构建慢病毒重组载体Lanti4-blockit-RELMβ-XynB-myc-GFP，转染原代培养的猪胎儿成纤维细胞，构建肠道定向表达XynB酶蛋白的真核细胞系。为进一步开展体细胞核移植克隆转XynB基因胚胎，培育高饲料利用率、低污染物排放的转基因猪新品种及其相关生物学科研与生产领域提供必要的转基因生物材料和关键技术体系支撑。

【技术实现步骤摘要】
一、
本专利技术涉木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系，属于生物
二、
技术介绍
环境友好型养殖业是畜牧业可持续健康发展的新方向。改革开放以来，随着我国国民经济的全面、快速发展，人民生活需求水平的不断提高，我国畜牧产业规模化取得了空前的发展。然而，随着畜牧场规模化、集约化和机械化程度的提高，畜禽粪便已成为一个不可忽视的污染源。同时，我国是一个养殖大国，饲料产量居世界第二，由于近年来我国养殖业的快速发展，加剧了人畜争粮矛盾，而且耕地面积日益减少，使粮食问题更加严峻。因此，增加饲料的营养价值，提高饲料的利用率和转化率，节约粮食资源就显得尤为重要。木聚糖酶作为一种环保型饲料酶制剂，应用于饲料中提高了饲料的营养价值，突破了饲料资源开发利用的局限，增强了动物的生产和抗病能力，减少了动物排泄物造成的污染，在发展环境友好型养殖业中具有重要的意义和价值。木聚糖是一种多聚五碳糖，是植物半纤维的重要组分，广泛存在于植物细胞壁中，它占植物碳水化合物总量的1/3，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的生物质资源。木聚糖可阻止细胞内养分释放、增加食糜黏度、阻碍饲料营养物质与消化液的接触、增加肠道不动水层厚度，使消化器官代偿性增加，并破坏肠道正常结构和微生态平衡，影响营养物质的消化吸收，因此木聚糖是一种典型的抗营养因子，因猪消化道内缺乏相应的内源性消化酶分解饲料中这类抗营养因子，用作猪饲料的玉米、豆粕中的木聚糖难以被有效利用，被直接排出体外，导致了饲料资源的浪费和严重的环境污染。内切β-木聚糖酶（endo-β-XynB）是水解木聚糖的关键酶，目前，国内外已经获得的木聚糖酶产酶微生物主要来源于自然界中的杆菌、黑曲霉菌、青霉菌属、木霉属以及放线菌属，大部分真菌源木聚糖酶具有嗜酸性，但细菌来源的最适pHopt均高于5.5，本专利技术选择研究来源于黑曲霉属的木聚糖酶基因，其酶蛋白pHopt在5.5左右，酶活性在动物胃的酸性环境中较高。基于以上研究进展，利用木聚糖酶分解植物中木聚糖的生物学特性，综合现在的分子和细胞生物学手段，采用转基因手段在目的动物体细胞中导入具有特殊生物学功能的外源木聚糖酶（XynB）基因，可望进一步通过转基因体细胞克隆技术途径，获得肠道中稳定表达和稳定遗传的转XynB基因的猪新品种（系）。抵抗素样分子β（resistin-like molecule β）又称发现于炎症带2（Found in inflammatory zone 2，FIZZ2），目前其相关研究主要集中在人类，生物学功能与肠管上皮细胞分化、细胞增殖、肠道免疫应答紧密相关，是研究肠道疾患及其靶向生物治疗的新靶标。研究发现，RELMβ基因高度表达于肠道组织。而RELMβ基因启动子是其高度表达于肠道的关键，相关研究表明，RELMβ基因启动子区包含多个肠上皮特异性转录调控因子。人和猪同源性非常高，因此猪RELMβ基因的生物学功能和启动子结构具有潜在的相似性。本专利技术克隆得到猪RELMβ启动子序列，并筛选得到活性最强启动子片段，将其构建成XynB基因的肠道定向表达载体，并进一步转染体细胞，构建转XynB基因的猪胎儿成纤维细胞系，解决了转基因猪体内目的基因在肠道内定向表达及其有效发挥其生物学功能的关键技术问题。三、
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系，是专用于生命科学和畜牧科研与生产的环保型的生物制品，可作为开展环境友好型转基因猪研究提供必要的生物材料及其相关关键技术方法参考。技术方案木聚糖酶肠道定向表达载体，是通过以下方法构建而成的：(1)以原核载体pRSETA-XynB为模板，根据XynB基因序列，设计PCR引物P1和P2，P1引物5’端引入Xho I酶切位点，在酶切位点与起始位点之间引入Kozak序列GCCACC，P2引物5’端引入Kpn I酶切位点和Myc-Tag序列CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTC：P1: 5’-CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3’Xho IP2:5’-GGGGTACCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTGAACAGTGATGGA-3’ Kpn IPCR 扩增条件为：98℃，5min；98℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；32个循环；72℃，5min，PCR扩增片段大小为678bp；将上述PCR终产物与pMD18T连接，得到克隆载体pMD18T-XynB-Myc；(2)将上述克隆载体pMD18T-XynB-Myc用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，同时用相同限制性内切酶双酶切pcDNA3.1(-)，将酶切回收的XynB-Myc目的片段和pcDNA3.1(-)载体片段由T4 DNA连接酶4℃连接过夜，得到XynB真核表达载体pcDNA3.1-XynB-Myc；    (3)根据XynB基因及GFP基因序列，设计PCR反应引物 P3 / P4 和 P5 / P6，引物 P3/P4 扩增 XynB-Myc，引物 P5/P6 扩增 GFP，P4有部分序列与GFP基因互补，P5有部分序列与XynB-Myc基因片段互补，P6引物5’端引入终止密码子TAA；P3: 5’-CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3’Xho IP4: 5’-CCTTGCTCACCATAGATCCTCTTCT-3’P5: 5’-GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG-3’P6: 5’-GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’Kpn I以pMD18T-XynB-Myc载体为模板，使用引物P3/P4，扩增XynB-Myc片段，大小为682bp；以质粒pEGFP-C3为模板，使用引物P5/P6，扩增GFP片段，大小为768bp；以上述扩增产物XynB-Myc片段及GFP片段为模板，用引物P3和P6，采用重叠PCR方法将两种组件融合，得到XynB-Myc-GFP片段，该融合片段的大小为1398bp，扩增程序为98℃，5min；98℃，30s；52℃，30s；72℃，90s；32个循环；72℃，10min；将上述PCR终产物XynB-myc-GFP片段与pMD18T 在4℃条件下连接，获得重组载体pMD18T-XynB-myc-GFP； (4)将中间载体pMD18T-XynB-myc-GFP用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，同时用同样的限制性内切酶双酶切pcDNA3.1(-)，将酶切回收的XynB-myc-GFP目的片段和pcDNA3.1(-)载体片段采用T4 DNA连接酶4℃连接过夜，获得真核表达载体pcDNA3.1(-)-XynB-myc-GFP；（5）猪RELMβ基因启动子区目前未见报道，猪和人基因同源性极高，根据Genebank中人RELMβ基因5’侧翼区序列AF352731，猪RELMβ基因cDNA序列NC_010455，按照5’端递减原则，设计PCR正向引物P7-P12，引本文档来自技高网...

【技术保护点】
木聚糖酶肠道定向表达载体，是通过以下方法构建而成的：(1)以原核载体pRSETA‑XynB为模板，根据XynB基因序列，设计PCR引物P1和P2，P1引物5’端引入Xho I酶切位点，在酶切位点与起始位点之间引入Kozak序列GCCACC，P2引物5’端引入Kpn I酶切位点和Myc‑Tag序列CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTC：P1: 5’‑CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT‑3’Xho IP2:5’‑GGGGTACCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTGAACAGTGATGGA‑3’ Kpn IPCR 扩增条件为：98℃，5min；98℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；32个循环；72℃，5min，PCR扩增片段大小为678bp；将上述PCR终产物与pMD18T连接，得到克隆载体pMD18T‑XynB‑Myc；(2)将上述克隆载体pMD18T‑XynB‑Myc用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，同时用相同限制性内切酶双酶切pcDNA3.1(‑)，将酶切回收的XynB‑Myc目的片段和pcDNA3.1(‑)载体片段由T4 DNA连接酶4℃连接过夜，得到XynB真核表达载体pcDNA3.1‑XynB‑Myc；(3)根据XynB基因及GFP基因序列，设计PCR反应引物 P3 / P4 和 P5 / P6，引物 P3/P4 扩增 XynB‑Myc，引物 P5/P6 扩增 GFP，P4有部分序列与GFP基因互补，P5有部分序列与XynB‑Myc基因片段互补，P6引物5’端引入终止密码子TAA；P3: 5’‑CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT‑3’Xho IP4: 5’‑CCTTGCTCACCATAGATCCTCTTCT‑3’P5: 5’‑GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG‑3’P6: 5’‑GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA‑3’Kpn I以pMD18T‑XynB‑Myc载体为模板，使用引物P3/P4，扩增XynB‑Myc片段，大小为682bp；以质粒pEGFP‑C3为模板，使用引物P5/P6，扩增GFP片段，大小为768bp；以上述扩增产物XynB‑Myc片段及GFP片段为模板，用引物P3和P6，采用重叠PCR方法将两种组件融合，得到XynB‑Myc‑GFP片段，该融合片段的大小为1398bp，扩增程序为98℃，5min；98℃，30s；52℃，30s；72℃，90s；32个循环；72℃，10min；将上述PCR终产物XynB‑myc‑GFP片段与pMD18T 在4℃条件下连接，获得重组载体pMD18T‑XynB‑myc‑GFP；(4)将中间载体pMD18T‑XynB‑myc‑GFP用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，同时用同样的限制性内切酶双酶切pcDNA3.1(‑)，将酶切回收的XynB‑myc‑GFP目的片段和pcDNA3.1(‑)载体片段采用T4 DNA连接酶4℃连接过夜，获得真核表达载体pcDNA3.1(‑)‑XynB‑myc‑GFP；（5）猪RELMβ基因启动子区目前未见报道，猪和人基因同源性极高，根据Genebank中人RELMβ基因5’侧翼区序列AF352731，猪RELMβ基因cDNA序列NC_010455，按照5’端递减原则，设计PCR正向引物P7‑P12，引物5’端引入NheⅠ酶切位点，反向引物P13，引物5’端引入XhoⅠ酶切位点，扩增不同长度猪RELMβ启动子片段：　序列5´‑3´目的片段大小/bpP7(‑842～+215)CTAGCTAGCGAACTTATGACCATGAGGAC1048P8(‑793～+215)CTAGCTAGCGATGAAGAGCCACTGAAC1017P9(‑574～+215)CTAGCTAGCAAATATGGCCCTAACTCAAC798P10(‑182～+215)CTAGCTAGCCTCCCCGATTCTCAAAAC406P11(‑147～+215)CTAGCTAGCGCTCCTCCATTCTGACAC371P12(‑86～+215)CTAGCTAGCTCTTTCCTTCCCAGCAAC310P13CCGCTCGAGATAATCAGACTGCTCAC　（6）上述扩增得到的RELMβs启动子片段连接到pMD18T载体，构建中间载体pMD18T‑RELMβs，pGL3‑Enhancer载体和上述获得的pMD18T‑RELMβs分别经NheⅠ和XhoⅠ双酶切、凝胶回收，使用T4 DNA连接酶4℃过夜连接，将RELMβs定向克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3‑Enhancer中，利用双酶切和测序方法，筛选构建正确的重组pGL‑RELMβs基...

【技术特征摘要】
1.木聚糖酶肠道定向表达载体，是通过以下方法构建而成的：
(1)以原核载体pRSETA-XynB为模板，根据XynB基因序列，设计PCR引物P1和P2，P1引物5’端引入Xho I酶切位点，在酶切位点与起始位点之间引入Kozak序列GCCACC，P2引物5’端引入Kpn I酶切位点和Myc-Tag序列CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTC：
P1: 5’-CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3’Xho I
P2:5’-GGGGTACCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTGAACAGTGATGGA-3’ Kpn I
PCR 扩增条件为：98℃，5min；98℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；32个循环；72℃，5min，PCR扩增片段大小为678bp；
将上述PCR终产物与pMD18T连接，得到克隆载体pMD18T-XynB-Myc；
(2)将上述克隆载体pMD18T-XynB-Myc用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，同时用相同限制性内切酶双酶切pcDNA3.1(-)，将酶切回收的XynB-Myc目的片段和pcDNA3.1(-)载体片段由T4 DNA连接酶4℃连接过夜，得到XynB真核表达载体pcDNA3.1-XynB-Myc；
(3)根据XynB基因及GFP基因序列，设计PCR反应引物 P3 / P4 和 P5 / P6，引物 P3/P4 扩增 XynB-Myc，引物 P5/P6 扩增 GFP，P4有部分序列与GFP基因互补，P5有部分序列与XynB-Myc基因片段互补，P6引物5’端引入终止密码子TAA；
P3: 5’-CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3’Xho I
P4: 5’-CCTTGCTCACCATAGATCCTCTTCT-3’
P5: 5’-GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG-3’
P6: 5’-GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’Kpn I
以pMD18T-XynB-Myc载体为模板，使用引物P3/P4，扩增XynB-Myc片段，大小为682bp；以质粒pEGFP-C3为模板，使用引物P5/P6，扩增GFP片段，大小为768bp；
以上述扩增产物XynB-Myc片段及GFP片段为模板，用引物P3和P6，采用重叠PCR方法将两种组件融合，得到XynB-Myc-GFP片段，该融合片段的大小为1398bp，扩增程序为98℃，5min；98℃，30s；52℃，30s；72℃，90s；32个循环；72℃，10min；
将上述PCR终产物XynB-myc-GFP片段与pMD18T 在4℃条件下连接，获得重组载体pMD18T-XynB-myc-GFP；
(4)将中间载体pMD18T-XynB-myc-GFP用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，同时用同样的限制性内切酶双酶切pcDNA3.1(-)，将酶切回收的XynB-myc-GFP目的片段和pcDNA3.1(-)载体片段采用T4 DNA连接酶4℃连接过夜，获得真核表达载体pcDNA3.1(-)-XynB-myc-GFP；
（5）猪RELMβ基因启动子区目前未见报道，猪和人基因同源性极高，根据Genebank中人RELMβ基因5’侧翼区序列AF352731，猪RELMβ基因cDNA序列NC_010455，按照5’端递减原则，设计PCR正向引物P7-P12，引物5’端引入NheⅠ酶切位点，反向引物P13，引物5’端引入XhoⅠ酶切位点，扩增不同长度猪RELMβ启动子片段：
序列5′-3′目的片段大小/bpP7(...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈哲，王公金，于建宁，徐小波，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32