木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系制造技术

本发明专利技术涉及木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系，属于生物技术领域。将XynB基因插入真核表达载体pcDNA3.1(-)，并构建慢病毒重组载体Lanti4-blockit-RELMβ-XynB-myc-GFP，转染原代培养的猪胎儿成纤维细胞，构建肠道定向表达XynB酶蛋白的真核细胞系。为进一步开展体细胞核移植克隆转XynB基因胚胎，培育高饲料利用率、低污染物排放的转基因猪新品种及其相关生物学科研与生产领域提供必要的转基因生物材料和关键技术体系支撑。

【技术实现步骤摘要】
一、
本专利技术涉木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系，属于生物
二、
技术介绍
环境友好型养殖业是畜牧业可持续健康发展的新方向。改革开放以来，随着我国国民经济的全面、快速发展，人民生活需求水平的不断提高，我国畜牧产业规模化取得了空前的发展。然而，随着畜牧场规模化、集约化和机械化程度的提高，畜禽粪便已成为一个不可忽视的污染源。同时，我国是一个养殖大国，饲料产量居世界第二，由于近年来我国养殖业的快速发展，加剧了人畜争粮矛盾，而且耕地面积日益减少，使粮食问题更加严峻。因此，增加饲料的营养价值，提高饲料的利用率和转化率，节约粮食资源就显得尤为重要。木聚糖酶作为一种环保型饲料酶制剂，应用于饲料中提高了饲料的营养价值，突破了饲料资源开发利用的局限，增强了动物的生产和抗病能力，减少了动物排泄物造成的污染，在发展环境友好型养殖业中具有重要的意义和价值。木聚糖是一种多聚五碳糖，是植物半纤维的重要组分，广泛存在于植物细胞壁中，它占植物碳水化合物总量的1/3，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的生物质资源。木聚糖可阻止细胞内养分释放、增加食糜黏度、阻碍饲料营养物质本文档来自技高网...

【技术保护点】
木聚糖酶肠道定向表达载体，是通过以下方法构建而成的：(1)以原核载体pRSETA‑XynB为模板，根据XynB基因序列，设计PCR引物P1和P2，P1引物5’端引入Xho I酶切位点，在酶切位点与起始位点之间引入Kozak序列GCCACC，P2引物5’端引入Kpn I酶切位点和Myc‑Tag序列CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTC：P1: 5’‑CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT‑3’Xho IP2:5’‑GGGGTACCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTGAACAGTGATGGA‑3’ Kpn IPCR 扩增条件为：98...

【技术特征摘要】
1.木聚糖酶肠道定向表达载体，是通过以下方法构建而成的：
(1)以原核载体pRSETA-XynB为模板，根据XynB基因序列，设计PCR引物P1和P2，P1引物5’端引入Xho I酶切位点，在酶切位点与起始位点之间引入Kozak序列GCCACC，P2引物5’端引入Kpn I酶切位点和Myc-Tag序列CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTC：
P1: 5’-CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3’Xho I
P2:5’-GGGGTACCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTGAACAGTGATGGA-3’ Kpn I
PCR 扩增条件为：98℃，5min；98℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；32个循环；72℃，5min，PCR扩增片段大小为678bp；
将上述PCR终产物与pMD18T连接，得到克隆载体pMD18T-XynB-Myc；
(2)将上述克隆载体pMD18T-XynB-Myc用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，同时用相同限制性内切酶双酶切pcDNA3.1(-)，将酶切回收的XynB-Myc目的片段和pcDNA3.1(-)载体片段由T4 DNA连接酶4℃连接过夜，得到XynB真核表达载体pcDNA3.1-XynB-Myc；
(3)根据XynB基因及GFP基因序列，设计PCR反应引物 P3 / P4 和 P5 / P6，引物 P3/P4 扩增 XynB-Myc，引物 P5/P6 扩增 GFP，P4有部分序列与GFP基因互补，P5有部分序列与XynB-Myc基因片段互补，P6引物5’端引入终止密码子TAA；
P3: 5’-CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3’Xho I
P4: 5’-CCTTGCTCACCATAGATCCTCTTCT-3’
P5: 5’-GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG-3’
P6: 5’-GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’Kpn I
以pMD18T-XynB-Myc载体为模板，使用引物P3/P4，扩增XynB-Myc片段，大小为682bp；以质粒pEGFP-C3为模板，使用引物P5/P6，扩增GFP片段，大小为768bp；
以上述扩增产物XynB-Myc片段及GFP片段为模板，用引物P3和P6，采用重叠PCR方法将两种组件融合，得到XynB-Myc-GFP片段，该融合片段的大小为1398bp，扩增程序为98℃，5min；98℃，30s；52℃，30s；72℃，90s；32个循环；72℃，10min；
将上述PCR终产物XynB-myc-GFP片段与pMD18T 在4℃条件下连接，获得重组载体pMD18T-XynB-myc-GFP；
(4)将中间载体pMD18T-XynB-myc-GFP用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，同时用同样的限制性内切酶双酶切pcDNA3.1(-)，将酶切回收的XynB-myc-GFP目的片段和pcDNA3.1(-)载体片段采用T4 DNA连接酶4℃连接过夜，获得真核表达载体pcDNA3.1(-)-XynB-myc-GFP；
（5）猪RELMβ基因启动子区目前未见报道，猪和人基因同源性极高，根据Genebank中人RELMβ基因5’侧翼区序列AF352731，猪RELMβ基因cDNA序列NC_010455，按照5’端递减原则，设计PCR正向引物P7-P12，引物5’端引入NheⅠ酶切位点，反向引物P13，引物5’端引入XhoⅠ酶切位点，扩增不同长度猪RELMβ启动子片段：
序列5′-3′目的片段大小/bpP7(...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈哲，王公金，于建宁，徐小波，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32