肾损伤因子1检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种肾损伤因子1检测试剂盒，包括七个储存组件，分别用于储存KIM‑1校准品、KIM‑1质控品、酶结合物工作液、磁珠工作液、清洗液、底物溶液和前处理试剂；磁珠工作液包括标记有KIM‑1抗体的羧基磁珠，酶结合物工作液包括碱性磷酸酶标记的抗KIM‑1抗体。本发明专利技术还公开了检测肾损伤因子1的检测方法。本发明专利技术公开的检测试剂盒，最低检测限为0.1ng/ml；线性范围为0.1‑1000ng/ml，检测灵敏度高，线性范围宽，检测时长缩短至15分钟，并简化了检测步骤。

【技术实现步骤摘要】
肾损伤因子1检测试剂盒
本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及一种肾损伤因子1检测试剂盒。
技术介绍
急性肾损伤(Acutekidneyinjury，AKI)是由多种原因引起的，可发生在各种临床情况下的一种复杂的肾功能减退综合征。它可以表现为血肌酐水平的轻微升高，也可以表现为急性肾衰竭。研究发现，AKI的发生与病死率的增加密切相关。这就要求医师在临床工作中能早期诊断，最好在肾小球滤过率开始下降，或者仅有组织损伤而肾小球滤过率尚正常的阶段及时发现并干预，以改善预后、降低病死率。血肌酐和尿量是目前AKI的诊断指标，但受到很多因素影响，敏感性和特异性都不高。因AKI诊断滞后，常贻误治疗的最佳时期。寻求具有高敏感性、特异性、易检测的新的生物标志物已经成为当前研究热点之一。肾损伤因子1(Kidneyinjurymolecμle-1，KIM-1)是一种黏附分子，可能是一种新的免疫球蛋白超家族的一员。采用基因芯片技术研究发现，KIM-1基因是大鼠缺血/再灌注模型肾脏中表达最显著的基因。近年的动物实验表明，KIM-1可能较其他标志物更为敏感。生理情况下，KIM-1仅在肝、肾、脾中有微弱表达,而在AKI时其表达显著增强。人类及啮齿类动物的近端肾小管损伤后，位于胞外的KIM-1蛋白脱落进入尿液。越来越多的研究已经在各种缺血、肾毒性和肾移植等所致AKI的动物模型中证实KIM-1可以作为早期、无创和特异的AKI诊断标志物。KIM-1作为新的候选AKI早期诊断标志物，有其优势：①敏感性高，其在正常组织不表达，AKI发生时，其在近端小管上皮细胞的表达才显著上调，并一直持续到细胞完全康复；②特异性很高，特别是对缺血性或肾毒性AKI特异性更高，在其他器官(在近年文献中仅发现有卵巢透明细胞癌时KIM-1升高的报道)很少表达；③其胞外部分脱落进入尿液后性质比较稳定，容易检测；④极少受到慢性肾脏疾病和尿路感染的影响。中国专利CN104730250A公开了一种人肾损伤分子的酶联免疫试剂盒，包括识别人肾损伤分子不同表位的单克隆抗体分别作为捕获抗体和检测抗体，以重组表达的人肾损伤分子作为抗原标准品。检测方法为：尿液样本先离心处理，取上清液，捕获抗体与上清液结合，形成捕获抗体-KIM1复合物，在加入检测抗体，与上述复合结合形成检测抗体-捕获抗体-KIM1复合物，加入显色液进行显色，通过酶标仪在450nm波长下检测发光值，计算样品中KIM-1的含量。该试剂盒检测时长至少三小时，检测时长太长，无法满足目前临床需求。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题是现有技术中检测肾损伤因子1检测时长太长的缺陷。进而提供一种检测快速且灵敏度高的检测肾损伤因子1的检测试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种肾损伤因子1检测试剂盒，包括第一储液组件，用于储存KIM-1校准品；第二储液组件，用于储存酶结合物工作液；第三储液组件，用于储存磁珠工作液；第四储液组件，用于储存清洗液；第五储液组件，用于储存底物溶液；第六储液组件，用于储存前处理试剂；第七储液组件，用于存储KIM-1质控品。可选的，所述磁珠工作液包括标记有KIM-1抗体的羧基磁珠；所述磁珠的粒径为1-5μm。可选的，所述标记有KIM-1抗体的羧基磁珠的浓度为0.1～1mg/ml。可选的，所述酶结合物工作液包括碱性磷酸酶标记的抗KIM-1抗体。可选的，所述碱性磷酸酶标记的抗KIM-1抗体的浓度为0.5～2μg/ml。可选的，所述KIM-1校准品和所述KIM-1质控品是含有KIM-1抗原的HEPES溶液。可选的，所述底物溶液为酶促化学发光底物溶液。可选的，所述前处理试剂是包括NaCl、蔗糖、甘油、吐温20以及防腐剂的缓冲液。本专利技术还提供一种检测肾损伤因子1的方法，使用所述的肾损伤因子1检测试剂盒检测，包括如下步骤：(1)将待测样本、KIM-1校准品以及KIM-1质控品分别加入到前处理试剂中，混匀后加入磁珠工作液、酶结合物工作液，混匀后37℃-42℃反应5min-10min，得到第一反应液；(2)将所述第一反应液进行磁分离，收集磁珠；通过清洗液清洗所述磁珠；(3)在清洗后的所述磁珠中加入底物溶液，得到混合液；检测所述混合液的发光强度。可选的，所述待测样本、所述KIM-1校准品或所述KIM-1质控品与所述前处理试剂的比例为1：1。可选的，所述磁珠工作液、所述酶结合物工作液与所述底物溶液的比例为1:1:2。本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：1.本专利技术实施例提供的检测试剂盒使用化学发光法技术与磁珠结合检测肾损伤因子1，通过前处理试剂，酶结合物工作液、磁珠工作液以及底物溶液的配合，使得检测肾损伤因子1的最低检测限为0.1ng/ml；线性范围为0.1-1000ng/ml，线性相关系数为r>0.99；；灵敏度高，线性范围宽。与现有技术相比，检测时间可缩短至15min，大大缩短了检测时长。2.本专利技术实施例提供的检测试剂盒包括前处理试剂，酶结合物工作液和磁珠工作液，无需对尿液样本进行过滤、离心等处理，加入前处理试剂，直接加入酶结合物工作液和磁珠工作液，简化了检测步骤，提高了检测效率。3.本专利技术实施例提供的检测试剂盒提供了KIM-1校准品和KIM-1质控品，保证了检测结果的准确性。4.本专利技术实施例提供的检测肾损伤因子1的方法，操作简单，检测时间短，灵敏度高，线性范围宽。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，以下通过具体实施例来说明本专利技术的实施方式，除非另外说明，本专利技术中所公开的实验方法均采用本
常规技术。实施例1本实施例提供一种制备酶结合物的方法，包括以下步骤：1.称取适量Traut′s试剂，用抗体活化缓冲液(100mM三乙醇胺缓冲液，pH8.5)配成成1.376mg/mL溶液。2.称取适量Sulfo-SMCC试剂，用二甲基甲酰胺DMF配成浓度为17.5mg/mL溶液。3.将KIM-1标记抗体保存在抗体活化缓冲液(100mM三乙醇胺缓冲液，pH8.5)，浓度为2mg/mL；向该溶液中加入步骤1配制的Traut′s溶液，KIM-1标记抗体与Traut′s试剂摩尔比为1:15，立刻混匀，25℃静置反应15分钟。4.向碱性磷酸酶溶液(AP溶液，浓度为20mg/ml)中加入步骤2配制的Sulfo-SMCC溶液，碱性磷酸酶与Sulfo-SMCC摩尔比1：10，立刻混匀，25℃静置反应15分钟。5.向步骤3活化反应结束得到的抗体溶液中加入1M的甘氨酸溶液，甘氨酸与Traut′s试剂的摩尔比为1:10，立刻混匀，25℃静置反应10分钟。6.向步骤4活化反应结束得到的AP溶液中加入1M的甘氨酸溶液，甘氨酸与Sulfo-SMCC试剂的摩尔比为1:10，立刻混匀，25℃静置反应10分钟。7.将步骤5反应结束的抗体溶液立刻脱盐，置换到交联缓冲液中(100mM三乙醇胺缓冲液，pH7.3)，紫外分光光度法测得抗体浓度；8.将步骤6反应结束的AP溶液立刻脱盐，置换到交联缓冲液中(100mM三乙醇胺缓冲液，pH7.3)，紫外分光光度法测得AP浓度；9.将步骤7活化好的抗体溶液与步骤8活化好的AP溶液混合，活化的KIM-1标记抗体与活化的碱性磷酸酶的摩尔比为1：1，充分混匀，2～8℃静置反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肾损伤因子1检测试剂盒，其特征在于，包括第一储液组件，用于储存KIM‑1校准品；第二储液组件，用于储存酶结合物工作液；第三储液组件，用于储存磁珠工作液；第四储液组件，用于储存清洗液；第五储液组件，用于储存底物溶液；第六储液组件，用于储存前处理试剂；第七储液组件，用于存储KIM‑1质控品。

【技术特征摘要】
1.一种肾损伤因子1检测试剂盒，其特征在于，包括第一储液组件，用于储存KIM-1校准品；第二储液组件，用于储存酶结合物工作液；第三储液组件，用于储存磁珠工作液；第四储液组件，用于储存清洗液；第五储液组件，用于储存底物溶液；第六储液组件，用于储存前处理试剂；第七储液组件，用于存储KIM-1质控品。2.根据权利要求1所述的肾损伤因子1检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠工作液包括标记有KIM-1抗体的羧基磁珠；所述磁珠的粒径为1-5μm。3.根据权利要求2所述的肾损伤因子1检测试剂盒，其特征在于，所述标记有KIM-1抗体的羧基磁珠的浓度为0.1-1mg/ml。4.根据权利要求1所述的肾损伤因子1检测试剂盒，其特征在于，所述酶结合物工作液包括碱性磷酸酶标记的抗KIM-1抗体。5.根据权利要求4所述的肾损伤因子1检测试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的抗KIM-1抗体的浓度为0.5～2μg/ml。6.根据权利要求1所述的肾损伤因子1检测试剂盒，其特征在于，所述KIM-1校准品和所述KIM-1质控品是含有KIM-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王保君，汤双双，欧卫军，唐启伟，徐艳，
申请(专利权)人：南通伊仕生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32