β2-微球蛋白测定试剂盒制造技术

本发明专利技术属于医学及生物化学技术领域，具体是一种β2‑微球蛋白检测试剂盒。该试剂盒由试剂R1、试剂R2和校准品组成，试剂R1包括：缓冲剂、防腐剂和水；试剂R2包括：包被β2‑微球蛋白抗体的乳胶颗粒、防腐剂和水；校准品包括：β2‑MG、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖、Proclin300。该β2‑微球蛋白检测试剂盒采用乳胶增强免疫比浊法来进行测定，相对于传统的β2‑微球蛋白检测试剂盒，具有快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好等优点。

【技术实现步骤摘要】
β2-微球蛋白测定试剂盒
本专利技术涉及医学及生物化学
，具体是一种测定β2-微球蛋白的试剂盒。
技术介绍
β2-微球蛋白在1968年首次被分离发现，是分子量为11815Da的血清蛋白质，其分子内含有一对二硫键，血清蛋白电泳位于β2区域。淋巴细胞、血小板、多核白细胞等均能合成β2-微球蛋白，且人体内几乎所有有核细胞均能合成β2-微球蛋白，但其主要是由淋巴细胞合成。β2-微球蛋白广泛存在于人的血清、脑脊液、尿液、初乳、唾液等体液中，且含量微小。β2-微球蛋白的合成稳定，正常情况下其平均生成速率约为2.4mg/kg/day，β2-微球蛋白的代谢仅依赖于肾脏，由细胞表面脱落或释放进入血液的微球蛋白，从肾小球自由滤过，99.9％在近端肾小管重吸收并分解代谢，不再流入血液循环，因而在正常情况下血清β2-微球蛋白含量稳定，正常人群血清β2-微球蛋白参考值范围为0-3mg/ml。β2-微球蛋白分子量小，极少有肾外的分解代谢，其在体内的产生速率很定，年龄、性别、肌体肌肉组织不会影响其血清水平含量。在体内β2-微球蛋白生成不增加的情况下，血清β2-微球蛋白水平升高是反映肾小球过滤功能损伤的极灵敏指标，而且比血清尿素氮、肌酐对肾小球滤过的评价更敏感。因此，β2-微球蛋白是诊断早期肾功能损伤的敏感指标，尤其对于糖尿病肾病、高血压肾病、红斑狼疮肾炎的早期诊断具有重要的临床应用价值。此外，由于所有有核细胞均可产生β2-微球蛋白，这也包括了肿瘤细胞，因此当机体发生肿瘤时，由于肿瘤合成β2-微球蛋白增加或其表面β2-微球蛋白释放增加或肿瘤致肾功能减退，均可引起β2-微球蛋白水平的升高。因此在肾功能没有损害的情况下，β2-微球蛋白可以作为肿瘤的血清标志物，被临床用于多种恶性肿瘤的诊断、预后评价和复发检测，如恶性血液病、口腔肿瘤等。由于β2-微球蛋白含量微小，因此要求其测定方法具备较高的分析灵敏度，最初Berggard等使用单向免疫扩散实验来进行体液中β2-微球蛋白的测定，随后使用放射免疫分析法对β2-微球蛋白的含量进行测定。此方法的灵敏度、特异性均良好，而且与单项免疫扩散试验具有良好的相关性，但是不足之处在于其存在放射性污染。此后，随着对β2-微球蛋白研究的深入和技术的进步，出现了酶免疫抑制法和ELISA法，这两种方法的敏感度、特异性以及精密度均高，不需要复杂的设备，也容易实现自动化，最重要的是解决了实验人员接触放射性污染存在人身安全的问题。但是酶免疫抑制法和ELISA法的酶促反应易受外界因素的干扰，存在操作繁琐、重复性差、准备工作多、受人为因素影响较大的缺点。胶乳增强比浊法是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。胶乳增强比浊法通过在高分子乳胶微球表面交联的单克隆抗体，而当抗原与交联有抗体的微球结合后，能够在短时间内迅速聚集在一起，改变反应溶液的吸光度。而且，反应液吸光度的改变与被测抗原的浓度在一定范围内具有线性关系，可用来反映被测抗原的浓度。胶乳免疫比浊法与上述其他几种方法相比较，存在操作简单、灵敏度高、线性范围宽、无污染、应用范围广等显著的特点，因此，胶乳免疫比浊法有着极大的研究价值。目前市场上已有胶乳增强免疫透射比浊法测定人血浆或尿液中β2-微球蛋白浓度的试剂盒，但这些试剂盒无法同时满足宽线性范围和高灵敏度的要求，因此需要稀释样本才能测定高浓度β2-微球蛋白，这在使用上带来了不便。现有的乳胶增强免疫比浊法，如专利CN102590526公开的试剂盒检测灵敏度为0.08mg/l，线性检测范围在18mg/l以下，难以满足临床的检测需求。因此，有必要开发一种同时具有高灵敏度和宽线性范围的β2-微球蛋白胶乳增强免疫透射比浊检测试剂盒。
技术实现思路
针对现有β2-微球蛋白在测试过程中存在的上述缺陷，本专利技术提供一种快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好、液体双试剂操作简便适用于临床全白动或半自动生化分析的β2-微球蛋白测定试剂盒。本专利技术涉及一种β2-微球蛋白检测试剂盒，包含试剂R1、试剂R2和校准品，其中试剂R1包含缓冲剂、防腐剂和水，试剂R2包含包被β2-微球蛋白抗体的乳胶颗粒、防腐剂和水，校准品包含被β2-微球蛋白、牛血清白蛋白和防腐剂。其中，所述试剂R2中包被β2-微球蛋白抗体的乳胶颗粒的粒径为1.5-2.0μm，优选为1.8-2.0μm。其中，所述的缓冲液选自磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种；防腐剂选自叠氮钠、ProClin防腐剂中的一种或几种。优选地，每1升试剂R1中各组分的用量为：缓冲剂5-100mmol，防腐剂0.2-10g；每1升试剂R2中各组分的用量为：β2-微球蛋白抗体的乳胶颗粒0.05-0.5mg，防腐剂0.2-10g。在一个具体的实施方案中，每1升试剂R1中各组分的用量为：氯化铵20mmol，叠氮钠0.95g；每1升试剂R2中各组分的用量为：β2-微球蛋白抗体的乳胶颗粒0.18mg，叠氮钠0.95g。优选地，试剂R2中还有聚六亚甲基胍和苯甲醇。在一个优选的实施方案中，试剂R2中聚六亚甲基胍的用量为0.5g/l，苯甲醇的用量为0.2g/l。本专利技术还提供了包被β2-微球蛋白抗体的乳胶颗粒的制备方法，该制备方法为化学交联法：(1)用MES缓冲液将表面带有羧基功能基团、直径1.5-2.0μm的聚苯乙烯微粒稀释至终浓度为0.5-3％(wt)，加入50-90mMEDAC，混合均匀，室温震荡反应30-80分钟；(2)将步骤(1)所得混合液离心，弃上清液，用MES缓冲液清洗两次，最终胶乳微粒重悬于MES缓冲液，超声进行分散，得微粒分散液；(3)用MES缓冲液稀释β2-微球蛋白抗体，与步骤(2)中微粒分散液混合，于室温反应2-4小时；(4)将步骤(3)所得反应液18000rpm离心30min后，用Tris缓冲液重悬微粒，室温封闭反应1-3小时；(5)将步骤(4)所得反应液离心，弃上清液，用Tris缓冲液清洗胶乳3次，最后用R2试剂保存液重悬胶乳沉淀并稀释至1％，超声充分分散后即获得包被β2-微球蛋白抗体的乳胶颗粒。具体而言，本专利技术的专利技术构思是：(1)大粒径乳胶表面包被抗体后，其与抗原亲和性较高，极大地提高了低浓度β2-微球蛋白时抗原抗体反应速率，从而提高了试剂的灵敏度；(2)当待测样品中β2-微球蛋白浓度较高时，因乳胶颗粒的浓度较低，所以不会发生聚集交联等现象，其浊度变化仍与NGAL的浓度成正比，从而提高了试剂的线性范围；(3)在采用大粒径的颗粒并使试剂中颗粒的浓度较低，同时达到了高灵敏度和宽线性范围的目的；(4)通过向试剂R2添加聚六亚甲基胍和苯甲醇，意料不到地使得该试剂在常温条件下的稳定性显著提高。综上所述，本专利技术与现有技术相比，具有如下优点。(1)本专利技术试剂盒通过使用大粒径乳胶颗粒，提高了低浓度β2-微球蛋白时抗原抗体的反应速率，从而降低了试剂盒的最低检出限并且提高了试剂盒的检测灵敏度。(2)本专利技术通过优化缓冲体系和乳胶颗粒的浓度，使试剂盒灵敏度高、稳定性好、特异性强，可用于检测人血清中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量，适用于全自动生化分析仪。(3)本专利技术通过优化包被β2-微球蛋白抗体的乳胶颗粒的浓度，使得在待测样品中β2-微球蛋白浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种β2‑微球蛋白检测试剂盒，其特征在于：由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成；所述试剂R1的组分包括：缓冲剂、防腐剂和水；所述试剂R2的组分包括：包被β2‑微球蛋白抗体的乳胶颗粒、防腐剂和水；其特征在于：所述的乳胶颗粒为粒径1.5‑2.0μm的聚苯乙烯乳胶颗粒。

【技术特征摘要】
1.一种β2-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于：由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成；所述试剂R1的组分包括：缓冲剂、防腐剂和水；所述试剂R2的组分包括：包被β2-微球蛋白抗体的乳胶颗粒、防腐剂和水；其特征在于：所述的乳胶颗粒为粒径1.5-2.0μm的聚苯乙烯乳胶颗粒。2.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液选自磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种；防腐剂选自叠氮钠、ProClin防腐剂中的一种或几种。3.按照权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：每1升试剂R1中各组分的用量为：缓冲剂5-100mmol，防腐剂0.2-10g；每1升试剂R2中各组分的用量为：β2-微球蛋白抗体的乳胶颗粒0.05-0.5mg，防腐剂0.2-10g。4.按照权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：每1升试剂R1中各组分的用量为：氯化铵20mmol，叠氮钠0.95g；每1升试剂R2中各组分的用量为：β2-微球蛋白抗体的乳胶颗粒0.18mg，叠氮钠0.95g。5.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中还有聚六亚甲基胍和苯甲醇。6.按照权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中聚六亚甲基胍的用量为0.5g/l，苯甲醇的用量为0.2g/l。7.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述包被β2-微...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈青松，林耀文，
申请(专利权)人：浙江夸克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33