成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）蛋白质的SRM/MRM测定制造技术

提供了用于直接在生物样品中定量成纤维细胞生长因子受体2蛋白质(FGFR2)的方法，所述生物样品通过选择反应监测(SRM)/多重反应监测(MRM)质谱的方法而已经固定在福尔马林中。所述生物样品可能是选自使用含有试剂/固定剂的福尔马林处理的组织和细胞，包括福尔马林固定的组织/细胞、福尔马林固定/石蜡包埋(FFPE)的组织/细胞、FFPE组织块和来自那些块的细胞，以及组织培养细胞。由所述生物样品制备的蛋白质样品，并且采用通过在所述蛋白质样品中定量至少一种由FGFR2衍生的片段肽来定量所述样品中的FGFR2蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)蛋白质的SRM/MRM测定本申请要求于2015年5月14日提交的临时申请No.62/161,757的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术介绍
人们使用一批杀伤正在生长和分裂的细胞并以多种方式发挥功能的治疗剂来治疗癌症。常见的化疗剂集合已被单独或联合使用了数十年，且该常见的试剂集合已成为临床肿瘤学实践中传统且常规的癌症治疗手段。这些传统的化疗剂通过杀伤所有快速分裂的细胞来发挥作用，大多数癌细胞的主要特性之一。然而，这些试剂也杀伤正在生长的正常细胞，因此这些试剂不被视作杀伤癌细胞的“靶向”方法。近年来，已开发出大量仅靶向癌细胞的癌症治疗剂，其中这些治疗剂特异性攻击仅由癌细胞表达而正常细胞不表达的蛋白质。这种方式被视癌症治疗的“靶向”方法。最近，以“靶向”方式杀伤癌细胞的另一种方法是特异性调控免疫系统以增强癌症患者的免疫系统杀伤癌细胞的能力。靶向成纤维细胞生长因子受体2蛋白质的治疗剂，也称为FGFR2，在早期临床试验中已显示出前景。然而，只有这些患者(即患者的癌细胞表达大量的FGFR2蛋白质)才可能受益于采用这些FGFR2靶向治疗剂进行的治疗。由于FGFR2在正常的组织和/或正常的上皮细胞中不能正常表达，下文所述的方法提供了基于定量蛋白质组学的测定，该测定提供了FGFR2信号途径活化的相关测量。具体而言，所述方法提供了质谱分析法，其量化来自癌症患者的福尔马林固定组织中的FGFR2，并能够改善用于癌症治疗的治疗决策。提供了从成纤维细胞生长因子受体2蛋白质的序列衍生的特定肽，也称为CD332、角质形成细胞生长因子受体、和KGFR，并且在本文中称为FGFR2。针对每种肽的肽序列和片段/过渡离子在基于质谱的选择反应监测(SRM)中特别有用，其也可称为多反应监测(MRM)测定，并且在本文中称为SRM/MRM。描述了使用肽进行FGFR2蛋白质的SRM/MRM定量分析。所述SRM/MRM测定可用于测量来自FGFR2蛋白质的一种或多种特定肽的相对或绝对定量水平，并因此提供用于测量从生物样品获得的给定蛋白质制剂中的FGFR2蛋白质含量的质谱方法。更具体地，SRM/MRM测定可直接测量由从诸如福尔马林固定的癌症患者组织的患者组织样品取得的细胞制备的复杂蛋白质裂解物样品中的那些肽。由福尔马林固定的组织制备蛋白质样品的方法描述在美国专利第7,473,532号中，其内容通过引用全文纳入本文。美国专利号7,473,532中描述的方法可使用获自表达病理学公司(ExpressionPathologyInc.)(马里兰州罗克维尔)的LiquidTissue试剂和方案方便地进行。来自癌症患者组织的最广泛且可方便获得的组织形式为福尔马林固定的石蜡包埋的组织。手术切除的组织的甲醛/福尔马林固定是迄今为止在全世界保存癌症组织样品的最常见方法，并且是用于标准病理学实践的公认惯例。甲醛水溶液被称为福尔马林。11100％11福尔马林由甲醛在水中的饱和溶液(约40体积％或37重量％)组成，其含有少量用于限制氧化和聚合程度的稳定剂，通常为甲醇。保藏组织的最常用方式是将整个组织在通常称为10％中性缓冲福尔马林的甲醛水溶液中长时间(8小时至48小时)浸泡，接着在室温下将固定的整个组织包埋在石蜡中以便长期储存。因此，分析福尔马林固定的癌症组织的分子分析方法将是用于分析癌症患者组织的最被接受且大量利用的方法。SRM/MRM测定的结果可用于关联自其中收集并保藏组织(生物样品)的患者或受试者的具体组织样品(例如癌症组织样品)内的FGFR2蛋白质的准确且精确的定量水平。这不仅提供关于癌症的诊断和预后信息，而且容许医师或其它医疗专业人员来更加准确地确定用于患者的适当疗法。提供关于在患病组织中或在其他患者样品中蛋白质表达水平的诊断、预后和治疗重要信息的这一测定称为伴随诊断测定。例如，这一测定可设计用于诊断癌症的阶段或程度，并确定患者最可能应答的治疗剂。
技术实现思路
本专利技术所述的测量来自FGFR2蛋白质的特定未修饰的肽的相对或绝对水平并且可测量来自FGFR2蛋白质的特定修饰的肽的绝对或相对水平。修饰的示例包括可能在这些肽上存在的磷酸化氨基酸残基和糖基化氨基酸残基。FGFR2蛋白质的相对定量水平可通过SRM/MRM方法确定，例如通过比较不同样品中单个FGFR2肽的SRM/MRM特征峰面积(signaturepeakarea)(例如，特征峰面积或积分的片段离子强度)来确定。或者，可以比较多个FGFR2特征肽的多个SRM/MRM特征峰面积，其中每个肽具有其自身的特异性SRM/MRM特征峰，以确定一种生物样品中的相对FGFR2蛋白质含量和一种或多种额外或不同的生物样品中的FGFR2蛋白质含量。以这种方式，在相同实验条件下通过两个或多个生物学样品确定相对于相同FGFR2肽或多肽的来自FGFR2蛋白质的特定肽或多肽的含量，并从而确定FGFR2蛋白质的含量。另外，确定单一样品内来自FGFR2蛋白质的一种或多种给定肽的相对定量的方法可以是通过SRM/MRM方法比较该肽的特征峰面积与同一来自生物样品的蛋白质制备物中的来自不同的一种或多种蛋白质的其他和不同的一种或多种肽的特征峰面积。以这种方式，在相同的样品内确定彼此相对的来自FGFR2蛋白质的特定肽的量，并从而确定FGFR2蛋白质的量。这些方法允许定量来自FGFR2蛋白质的单个肽或多肽相对样品之间和样品内的另一个肽或多肽的量，其中由特征峰面积确定的量是彼此相对的，而与来自生物样品的蛋白质制剂中FGFR2肽的绝对重量∶体积或重量∶重量的含量无关。将不同样品之间单个特征峰面积的相对定量数据标准化至每种样品的所分析蛋白质的含量。相对定量可跨越来自单一样品中同时存在的多种蛋白质和FGFR2蛋白质的许多肽和/或跨越许多样品进行，以了解一种肽/蛋白质相对于其他肽/蛋白质的相对蛋白质含量。FGFR2蛋白质的绝对定量水平通过例如SRM/MRM方法确定，通过该方法将来自在一种生物样品中的FGFR2蛋白质的单个肽的SRM/MRM特征峰面积与“掺入”的内标物的SRM/MRM特征峰面积相比较。在一个实施方式中，该内标物为合成形式的完全相同的FGFR2肽，其含有用一种或多种重同位素标记的一个或多个氨基酸残基。合成这类同位素标记的内标物，使得当通过质谱进行分析时产生可预测且一致的SRM/MRM特征峰，其与天然FGFR2肽特征峰不同且截然不同并可用作比较峰。因此，当内标物掺入已知含量的来自生物样品的蛋白质制剂中并通过质谱分析时，可将天然肽的SRM/MRM特征峰面积与内标肽的SRM/MRM特征峰面积相比较，并且该数值比较显示来自生物样品的原始蛋白质制剂中存在的天然肽的绝对摩尔浓度和/或绝对重量。片段肽的绝对定量数据根据每种样品中所分析的蛋白质的含量来显示。可在单个样品中和/或在许多样品上的多个肽、以及这样的蛋白质上同时进行绝对定量，以了解单个生物样品中和整个单个样品的组中的绝对蛋白质含量。SRM/MRM测定方法可用于帮助癌症阶段的诊断和/或患者预后，例如，直接在来源于患者的组织(例如福尔马林固定的组织)中进行，并帮助确定哪种治疗剂用于治疗该患者最有利。分析通过手术(例如治疗性去除部分或全部肿瘤)或通过用于确定疑似疾病存在或不存在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测量生物样品中成纤维细胞生长因子受体2蛋白质(FGFR2)水平的方法，包括使用质谱检测和/或定量来自所述生物样品的蛋白质消化物中一种或多种修饰的或未修饰的FGFR2片段肽的含量；和计算所述样品中修饰的或未修饰的FGFR2蛋白质的水平；且其中所述水平是相对水平或绝对水平。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.14 US 62/161,7571.一种测量生物样品中成纤维细胞生长因子受体2蛋白质(FGFR2)水平的方法，包括使用质谱检测和/或定量来自所述生物样品的蛋白质消化物中一种或多种修饰的或未修饰的FGFR2片段肽的含量；和计算所述样品中修饰的或未修饰的FGFR2蛋白质的水平；且其中所述水平是相对水平或绝对水平。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在检测和/或定量一种或多种修饰的或未修饰的FGFR2片段肽之前对所述蛋白质消化物进行分级的步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的分级的步骤选自由凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反相液相色谱、高效液相色谱或反相高效液相色谱组成的组。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述生物样品的所述蛋白质消化物通过LiquidTissue方案制备。5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述蛋白质消化物包含蛋白酶消化物。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质消化物包含胰蛋白酶消化物。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述质谱包括串联质谱、离子阱质谱、三重四极质谱、MALDI-TOF质谱、MALDI质谱和/或飞行时间质谱。8.根据权利要求7所述的方法，其中所使用的质谱的模式是为选择反应监测(SRM)、多重反应监测(MRM)和/或多重选择反应监测(mSRM)。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述FGFR2片段肽包括如SEQIDNO：1和SEQIDN0：2所示的氨基酸序列。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述生物样品是血液样品、尿样品、血清样品、腹水样品、疲液样品、淋巴液、唾液样品、细胞或实体组织。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述组织是福尔马林固定的组织。12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述组织是石蜡包埋的组织。13.根据权利要求10所述的方法，其中所述组织从肿瘤获得。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述肿瘤是原发性肿瘤。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述肿瘤是继发性肿瘤。16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，进一步包括定量修饰的或未修饰的FGFR2片段肽。17.根据权利要求16所述的方法，其中定量所述FGFR2片段肽包括比较一种生物样品中如SEQIDNO：1和SEQIDN0：2所示的包含FGFR2的约...

【专利技术属性】
技术研发人员：大卫·B·克里茨曼，托德·哈姆布拉夫，史诺·塞帕洛姆比尔，辽卫礼，
申请(专利权)人：爱科谱迅病理研究公司，
类型：发明
国别省市：美国,US