本发明专利技术提供了来自丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B‑raf(BRAF)的具体的肽和这些肽的衍生电离特性，其特别有利于通过选择反应监测(SRM)质谱或也可称作多反应监测(MRM)质谱的方法直接定量已经在福尔马林中固定的生物样品中的BRAF蛋白质。这类生物样品是经化学保藏和固定的，该生物样品选自使用含有试剂/固定剂的甲醛处理的组织和细胞，包括福尔马林固定的组织/细胞、福尔马林固定/石蜡包埋(FFPE)的组织/细胞、FFPE组织块和来自那些块的细胞，以及经福尔马林固定和或石蜡包埋的组织培养细胞。使用Liquid Tissue试剂和方案从该生物样品中制备蛋白质样品并通过在蛋白质样品中定量至少一种或多种所描述的肽来使用SRM/MRM质谱的方法在Liquid Tissue样品中定量BRAF蛋白质。这些肽在其以修饰的或未修饰的形式存在时可被定量。BRAF肽的修饰的形式的一个示例是肽序列内酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸和/或其他氨基酸残基的磷酸化。
SRM / MRM determination of serine / threonine protein kinase B-Raf (BRAF)
【技术实现步骤摘要】
针对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf(BRAF)的SRM/MRM测定相关申请本申请是申请号为201580035587.2、申请日为2015年07月13日、享有申请日为2014年07月11日的申请号为US62/023,615的美国在先申请优先权的，专利技术名称为“针对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf(BRAF)的SRM/MRM测定”的中国专利技术专利申请的分案申请。引言提供了来源于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf(其也称作原癌基因B-Raf、p94、v-Raf鼠肉瘤病毒癌基因同系物B1和BRAF，并在本文中称作“BRAF”)的亚序列的特定肽。各种肽的肽序列和碎片/过渡离子可用于基于质谱的选择性反应监测(SRM)测定中，其也称为多反应监测(MRM)测定，且在本文中称作SRM/MRM。描述了用于BRAF蛋白质的SRM/MRM定量分析的肽的用途。可使用该SRM/MRM测定来测量来自BRAF蛋白质的一种或多种特异性肽的相对或绝对定量水平，并由此提供通过质谱测量在从生物样品中获得的给定蛋白质制备物中BRAF蛋白质的总量的方法。更具体地，该SRM/MRM测定可直接测量由从诸如福尔马林固定的癌症患者组织的患者组织样品取得的细胞制备的复杂蛋白质裂解物样品中的那些肽。由福尔马林固定的组织制备蛋白质样品的方法描述在美国专利第7,473,532号中，其内容通过引用全文纳入本文。该专利描述的方法可使用获自表达病理学公司(ExpressionPathologyInc.)(马里兰州罗克维尔)的试剂和方案方便地进行。可最广泛且有利地获得的来自癌症患者组织的组织形式是福尔马林固定、石蜡包埋的组织。对手术移出的组织进行甲醛/福尔马林固定是迄今为止世界范围内最常见的保存癌症组织样品的方法且是标准病理学实践中已经接受的常规方法。甲醛水溶液被称作福尔马林。“100％”福尔马林由甲醛在水中的饱和溶液(约40体积％或37重量％)组成，其含有少量用于限制氧化和聚合程度的稳定剂，通常为甲醇。保藏组织的最常用方式是将整个组织在通常称为10％中性缓冲福尔马林的甲醛水溶液中长时间(8小时至48小时)浸泡，接着在室溫下将固定的整个组织包埋在石蜡中以便长期储存。因此，分析福尔马林固定的癌症组织的分子分析方法将是用于分析癌症患者组织的最被接受且大量利用的方法。SRM/MRM测定的结果可用于关联自其中收集并保藏组织(生物样品)的患者或受试者的具体组织样品(例如癌症组织样品)内BRAF蛋白质的准确且精确的定量水平。这不仅提供关于癌症的诊断和预后信息，而且容许医师或其它医疗专业人员更精确地确定用于患者的适当疗法。提供关于患病组织或其他患者样品中蛋白质表达水平的诊断、预后和治疗重要信息的这一测定称为伴随诊断测定。例如，这一测定可设计用于诊断癌症的阶段或程度并确定患者最可能应答的治疗剂。
技术实现思路
本专利技术所述的测定测量来自BRAF蛋白质的特定未修饰的肽的相对或绝对水平并且可测量来自BRAF蛋白质的特定修饰的肽的绝对或相对水平。修饰的示例包括可能在这些肽上存在的磷酸化氨基酸残基和糖基化氨基酸残基。BRAF蛋白质的相对定量水平通过SRM/MRM方法来确定，通过例如比较不同样品中单个BRAF肽的SRM/MRM特征峰面积(signaturepeakarea)(例如，特征峰面积或积分的片段离子强度)来确定。或者，在各种肽具有其自己的特异性SRM/MRM特征峰的情况下，可以比较多种BRAF特征肽的多个SRM/MRM特征峰面积，从而确定一种生物样品中的相对BRAF蛋白质含量并将其与一种或多种额外或不同的生物样品中的BRAF蛋白质含量比较。以此方式，可在相同实验条件下跨越两个或多个生物样品，相对于相同的一种或多种BRAF肽来确定来自BRAF蛋白质的一种或多种特定肽的含量并从而确定BRAF蛋白质的含量。另外，确定单一样品内来自BRAF蛋白质的一种或多种给定肽的相对定量的方法可以是通过SRM/MRM方法比较该肽的特征峰面积与同一来自生物样品的蛋白质制备物中的来自不同的一种或多种蛋白质的其他和不同的一种或多种肽的特征峰面积。以此方式，通过同一样品内相对于一种肽的另一种肽来确定来自BRAF蛋白质的特定肽的含量并从而确定BRAF蛋白质的含量。这些方法能够进行样品之间或样品内单个或多个来自BRAF蛋白质的肽相对于另一个或多个肽的定量，其中通过特征峰测定的含量彼此相对，这与来自生物样品的蛋白质制备物中BRAF肽的绝对重量:体积或重量:重量含量无关。不同样品之间单个特征峰面积的相对定量数据可标准化至每个样品中所分析的蛋白质含量。可跨越来自单个样品中同时存在的BRAF蛋白质和多个蛋白质的许多肽和/或跨越许多样品来进行相对定量，从而了解相对于其他肽/蛋白质的一种肽/蛋白质的相对蛋白质含量。BRAF蛋白质的绝对定量水平通过例如SRM/MRM方法确定，通过该方法将来自在一种生物样品中的BRAF蛋白质的单个肽的SRM/MRM特征峰面积与掺入的(spiked)内标物的SRM/MRM特征峰面积相比较。在一个实施方式中，该内标物为合成形式的完全相同的BRAF肽，其含有用一种或多种重同位素标记的一个或多个氨基酸残基。合成这类同位素标记的内标物，使得通过质谱分析时其产生可预测且一致的SRM/MRM特征峰，其与天然BRAF肽特征峰不同且截然不同并因此可用作比较峰。因此，当内标物以已知含量掺入来自生物样品的蛋白质或肽制剂中并通过质谱分析时，将天然肽的SRM/MRM特征峰面积与内标肽的SRM/MRM特征峰面积相比较，且该数值比较显示来自生物样品的原始蛋白质制剂中存在的天然肽的绝对摩尔浓度和/或绝对重量。片段肽的绝对定量数据根据每种样品中所分析的蛋白质的含量来显示。绝对定量可跨越单个样品中同时存在的许多肽(且因此许多蛋白质)和/或跨越许多样品进行，从而了解单个生物样品中和整个单个样品的组中的绝对蛋白质含量。该SRM/MRM测定方法可用于辅助诊断例如直接位于患者来源的组织如福尔马林固定的组织中的癌症的阶段和/或患者预后，并辅助确定哪种治疗剂将最有利地用于治疗该患者。对经由手术(如部分或全部肿瘤的治疗性移出)或经由为了确定疑似疾病的存在与否而进行的活检方法从患者移出的癌症组织进行分析以确定该患者组织中是否存在特定的一种或多种蛋白质以及存在何种形式的蛋白质。此外，可确定一种蛋白质或多种蛋白质的表达水平并将其与在健康组织中发现的“正常”或参考水平相比较。在健康组织中发现的蛋白质的正常或参考水平可来源于例如没有癌症的一个或多个个体的相关组织。或者，可通过分析未受癌症影响的相关组织来获得具有癌症的个体的正常或参考水平。蛋白质水平(例如BRAF水平)的测定还可用于通过BRAF水平诊断具有癌症的患者或受试者中癌症的阶段和提供相关预后信息。单个BRAF肽的水平定义为单位的所分析蛋白质裂解物总量中通过SRM/MRM测定确定的肽的摩尔含量。可通过关联BRAF蛋白质(或BRAF蛋白质的片段肽)的水平与正常组织中观察到的水平来使用BRAF相关的信息帮助确定癌症的阶段或等级和/或患者预后。一旦确定了癌症的阶段和/或等级和/或BRAF蛋白质表达特性，则可将该信息与经开发以特异性治疗癌症组织的治疗剂(化学和生物的)的列表相匹配，该癌症组织的特征是例如所测定的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测和定量蛋白质消化物中的BRAF片段肽的含量的试剂在制备用于测量福尔马林固定组织的生物样品中BRAF酪氨酸激酶受体蛋白质BRAF水平的试剂中的应用，其中所述片段肽为如选自以下组成的组中的一种氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的肽，且其中所述BRAF片段肽的含量使用质谱进行检测和定量；且其中所述水平是相对水平或绝对水平。
【技术特征摘要】
2014.07.11 US 62/023,6151.一种用于检测和定量蛋白质消化物中的BRAF片段肽的含量的试剂在制备用于测量福尔马林固定组织的生物样品中BRAF酪氨酸激酶受体蛋白质BRAF水平的试剂中的应用，其中所述片段肽为如选自以下组成的组中的一种氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所示的肽，且其中所述BRAF片段肽的含量使用质谱进行检测和定量；且其中所述水平是相对水平或绝对水平。2.权利要求1所述的应用，其中，在检测和定量所述BRAF片段肽的含量之前对所述蛋白质消化物进行分级。3.权利要求2所述的应用，其中所述分级的步骤选自液相色谱、纳米反相液相色谱、高效液相色谱或反相高效液相色谱。4.权利要求1-3中任一项所述的应用，其中所述蛋白质消化物包括蛋白酶消化物。5.权利要求4所述的应用，其中所述蛋白质消化物包括胰蛋白酶消化物。6.权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：大卫·B·克里茨曼，托德·哈姆布拉夫，史诺·塞帕洛姆比尔，辽卫礼，
申请(专利权)人：爱科谱迅病理研究公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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