一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法技术

本发明专利技术提供一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，(1)收集患者的血液样本或者病灶组织活检样本；(2)利用金属元素标记的抗体对样本中的细胞同时进行多靶点标记；(3)将标记好的细胞样品通过质谱流式检测系统进行检测；(4)基于所得到的质谱流式检测数据，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析，定量分析肿瘤免疫靶点在不同亚群细胞中的表达水平；(5)经过数据处理和降维算法计算后，绘制二维散点图、SPADE图或热图，进行可视化数据展示；构建信息学分析模型，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析。本发明专利技术高通量分析检测提供高灵敏度检测稀有类型的免疫细胞群体，以及弱表达的抗原，提高免疫分型分析精确性，有临床应用前景。

A quantitative analysis method of immunocytochemical typing based on single cell

【技术实现步骤摘要】
一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法
本专利技术涉及生物技术，具体涉及免疫细胞的分析方法，尤其涉及一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法。
技术介绍
人体的免疫系统由数量庞大以及类型非常丰富的免疫细胞组成。免疫细胞主要有两大类，淋巴细胞以及骨髓细胞。其中骨髓细胞有粒细胞，单核细胞等，按照细胞形态以及功能的差别又可以分为嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，中性粒细胞，单核细胞在不同种类的细胞分化因子的刺激性又会分化成各种类型的巨噬细胞或树突状细胞。淋巴细胞是白细胞的一种，是参与机体免疫应答功能最重要的细胞组成成分。按照淋巴细胞分化来源、细胞表面携带的表面抗原以及参与功能的不同，可以分为T淋巴细胞，B淋巴细胞、自然杀伤细胞等类别。其中T细胞又可分为细胞毒性T细胞，辅助性T细胞，调节性T细胞，记忆T细胞等；B细胞又可分为初始B细胞，浆细胞，记忆B细胞等亚细胞类群。目前在免疫学领域目前已经发现了上百种细胞表面标志物，不同谱系细胞在分化、成熟、活化过程中，出现或者消失的特定抗原，称为分化抗原(CD分子)。这些CD分子主要是免疫细胞表面的黏附分子、细胞因子受体或趋化因子受体等，可以被特定的抗体所识别。这些分子在不同类型的免疫细胞上具有高度的差异性，通过对这些细胞表面标志物的分析可以将免疫细胞分为更为细致的亚细胞分类群，例如辅助性T细胞又可进一步分成原始辅助性T细胞，1型辅助T细胞，2型辅助T细胞，9型辅助T细胞，17型辅助T细胞，22型辅助T细胞，辅助性耗竭T细胞，辅助效应记忆T细胞，辅助中心记忆T细胞等。免疫细胞分型和多种疾病有着密切的关系。对免疫细胞亚群的绝对定量或多种类群细胞的相对定量，对于如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、I型糖尿病、炎症、病毒感染等多种疾病病理进程的判断、分析发病机制、分析疾病中免疫系统变化程度具有非常重大的意义。例如CD4+T淋巴细胞的绝对计数临床上可用于HIV感染者的疾病分期，以及并发症判断；单核细胞表面HLA-DR的表达与手术和创伤后患者的预后成正相关；CD4+T淋巴细胞/CD8+T淋巴细胞比值异常升高常见于类风湿性关节炎、I型糖尿病，以及器官移植后CD4+T淋巴细胞/CD8+T淋巴细胞比例明显升高预示免疫排斥发生的可能性较高；CD4+/CD25+/Foxp3+T细胞是免疫耐受的重要参与者，其数量异常可能导致自身免疫疾病的发生，也会用作骨髓移植术前术后的跟踪。当前用于免疫细胞分型的方法主要有：免疫酶标法，流式细胞术法等。其中免疫酶标法是基于抗原抗体反应，对一个群体的免疫细胞所携带的一个或几个标志物进行检测，但这种方法无法在单细胞水平进行检测，需要的样本细胞数量大，无法同时检测多种细胞标志物，而且存在检测范围窄、操作复杂等缺点，在临床应用中只能检测某几个特定细胞类型。流式细胞术通过多种抗体组合方式，可以在单细胞水平对免疫细胞做足够细致的亚细胞类群分型，其操作相对简单，在临床中得到广泛的应用。但是流式细胞术中，当多通道荧光标记同时使用时，由于荧光发射光谱之间存在重叠，会出现假阳性信号而干扰检测结果。目前普遍的做法是通过荧光补偿的方法修正信号的采集，尽管采用了荧光补偿进行修正，但临床中应用流式细胞术通常采用最多4色组合方案，以保证分析的可靠性，无法在同一个细胞样品中同时对更多的标志分子进行检测。此外，流式细胞仪对单细胞的荧光进行检测理论上可以低至100个荧光分子，但当抗原分子表达量非常低时，检测结果可能会出现很大偏差。因此临床上对免疫细胞分型的检测需要一种新型的检测手段，可以在单细胞水平对足够多的抗原分子同时进行检测，这对细胞量极少的珍贵样本尤为重要；而且要求检测要有足够的灵敏度，以分析弱表达抗原以及稀有细胞群体。质谱流式是一种新型的流式分析系统，其利用质谱原理来实现单细胞多参数检测的流式技术。其检测原理为通过金属元素标记的抗体对细胞进行染色，通过质谱检测器分析金属元素的含量从而对单个细胞多种蛋白水平进行分析，具有通道多，分析速度快，灵敏度高的特点。因此，基于质谱流式技术在单细胞水平对免疫细胞分型进行定量分析具有十分显著的优势，拟进一步研究开发。本专利技术的目的在于提供一种新的基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，解决现有的分析方法中的不足之处，一方面针对免疫细胞高度差异性的特点，在单细胞水平对所有类型的免疫细胞中足够多的抗原标志同时进行高通量分析检测，尽可能用更少的细胞样本获得更多的有效信息；另一方面提供足够高的灵敏度，从而可以稳定可靠地检测稀有类型的免疫细胞群体，以及弱表达的抗原，从而提高免疫分型分析的精确性，为临床中疾病的诊断，疗效的检测等提供更加准确的分析结果。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计针对免疫细胞高度差异性的特点，在单细胞水平对所有类型的免疫细胞中足够多的抗原标志同时进行高通量分析检测，本专利技术提供一种新的基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法。本专利技术方法的检测原理为通过金属元素标记的抗体对细胞进行染色，通过质谱检测器分析金属元素的含量从而对单个细胞多种蛋白水平进行分析，具有通道多，分析速度快，灵敏度高的特点。质谱流式技术可以在单细胞水平对所有的免疫细胞多种抗原分子进行同时标记，其灵敏度远高于流式细胞术，而且基于质谱方式对金属元素标签进行的分析可以提供足够大的分辨度，避免了流式细胞术中荧光标签之间的相互影响的情况。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种基于单细胞的高通量免疫细胞分型定量分析方法，包括以下步骤：(1)收集患者的血液样本或者病灶组织活检样本；(2)利用金属元素标记的抗体对样本中的细胞同时进行多靶点标记；(3)将标记好的细胞样品通过质谱流式检测系统进行检测；(4)基于所得到的质谱流式检测数据，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析，定量分析肿瘤免疫靶点在不同亚群细胞中的表达水平。(5)经过数据处理和降维算法计算后，绘制二维散点图、SPADE图或热图等，进行可视化数据展示；构建信息学分析模型，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析。本专利技术方法所述步骤(1)将血液样本离心、过滤后用1mL磷酸盐缓冲液重悬制成单细胞悬液，或者活检组织样本用解剖剪刀解离成细碎小块，加入0.025％胰蛋白酶细胞消化液，37℃消化10分钟，经70微米滤膜过滤，制备成单细胞悬液；单细胞悬液加入1/10体积的16％甲醛溶液，室温(25℃)固定10分钟；弃去上清，加入1mL染色缓冲液(含有0.5％的牛血清白蛋白及0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液)清洗细胞，离心弃去上清，重复2次，并用0.5mL染色缓冲液重悬细胞；进一步地，将细胞重悬液中加入步骤(2)中所述含有0.5％的牛血清白蛋白及0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液配制的、带有金属元素标签标记的、用于免疫细胞分型的抗体的染色缓冲液配制的金属标记的抗体混合物，室温混合孵育30分钟；本专利技术方法步骤(2)中所述抗体包括4部分：a)免疫细胞基础分型组合b)骨髓细胞分型组合c)T淋巴细胞分型组合d)B淋巴细胞分型组合，使用中根据检测的目的选择a)免疫细胞基础分型组合或加上b)、c)、d)中一种或多种组合进行联合标记，即可选择其中任意1种或多种组合进行联合标记。每个组合所包含的抗体和其对应的克隆编号，以及标记时优选的金属标签组合如下：a)免疫细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)收集患者的血液样本或者病灶组织活检样本；(2)利用金属元素标记的抗体对样本中的细胞同时进行多靶点标记；(3)将标记好的细胞样品通过质谱流式检测系统进行检测；(4)基于所得到的质谱流式检测数据，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析，定量分析肿瘤免疫靶点在不同亚群细胞中的表达水平；(5)经过数据处理和降维算法计算后，绘制二维散点图、SPADE图或热图，进行可视化数据展示；构建信息学分析模型，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析。

【技术特征摘要】
1.一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)收集患者的血液样本或者病灶组织活检样本；(2)利用金属元素标记的抗体对样本中的细胞同时进行多靶点标记；(3)将标记好的细胞样品通过质谱流式检测系统进行检测；(4)基于所得到的质谱流式检测数据，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析，定量分析肿瘤免疫靶点在不同亚群细胞中的表达水平；(5)经过数据处理和降维算法计算后，绘制二维散点图、SPADE图或热图，进行可视化数据展示；构建信息学分析模型，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析。2.根据权利要求1所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，所述步骤(1)将血液样本离心、过滤后用1mL磷酸盐缓冲液重悬制成单细胞悬液，或者活检组织样本用解剖剪刀解离成细碎小块，加入0.025％胰蛋白酶细胞消化液，37℃消化10分钟，经70微米滤膜过滤，制备成单细胞悬液；单细胞细胞悬液中加入1/10体积的16％甲醛溶液，25℃固定10分钟；弃去上清，加入1mL染色缓冲液清洗细胞，离心弃去上清，重复2次，并用0.5mL染色缓冲液重悬细胞；所述染色缓冲液为含有0.5％的牛血清白蛋白及0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液。3.根据权利要求1所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，所述步骤(2)将单细胞悬液中加入所述染色缓冲液配制的金属标记的抗体混合物，室温25℃混合孵育30分钟。4.根据权利要求1所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，步骤(2)所述抗体包括：a)免疫细胞基础分型组合、b)骨髓细胞分型组合、c)T淋巴细胞分型组合、d)B淋巴细胞分型组合，使用时选择其中任意1种或多种组合进行联合标记。5.根据权利要求4所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，步骤(2)所述a)免疫细胞基础分型组合抗体组合选自识别下列靶点的抗体：CD45、CD11b、CD16、CD20、CD56、CD3、CD11c、CD19、CD27、CD8a、CD4、CD14；所述骨髓细胞分型组合抗体组合选自识别下列靶点的抗体：CD11c、CD123、CD68、CD66、CD13、CD11a、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD33、HLA-DR、Siglec8；所述T淋巴细胞分型组合抗体组合选自识别下列靶点的抗体：CD127、CD45RA、CD45RO、FOXP3、CD183/CXCR3、CD185/CXCR5、CD194/CCR4、CD196/CCR6、CD197/CCR7、TCRgd、CD25/IL-2RA、C...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏然，王宇翀，孙双午，
申请(专利权)人：上海宸安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31