一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法技术方案

本发明专利技术提供了一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法，包括以下步骤：(1)收集肿瘤患者的癌组织活检样本或血液样本进行处理，制备单细胞悬液；(2)利用金属元素标记的抗体对上述重悬的单细胞悬液同时进行多靶点标记；(3)将标记好的单细胞样品通过质谱流式系统进行检测；(4)基于所得到的质谱流式检测数据，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析，定量分析肿瘤免疫检查点蛋白在不同亚群细胞中的表达水平。本发明专利技术在高度异质性的肿瘤相关免疫细胞中准确反映肿瘤免疫治疗临床响应程度的免疫细胞亚群；确定合适的肿瘤免疫检查点蛋白的表达水平阈值，使检测结果获得最佳的临床相关性。有较好的临床应用前景和较大的社会效益。

A method for single cell detection of tumor samples by mass spectrometry flow cytometry

【技术实现步骤摘要】
一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法
本专利技术涉及医疗器械，具体涉及单细胞检测的方法，尤其涉及利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法。
技术介绍
在肿瘤微环境中存在复杂的肿瘤免疫应答，机体的免疫系统可以识别并清除存在的肿瘤细胞，肿瘤免疫应答主要分为7个环节：1.释放肿瘤抗原；2.呈递肿瘤抗原；3.激活效应T细胞；4.T细胞向肿瘤组织转移；5.T细胞浸润肿瘤组织；6.T细胞识别肿瘤细胞；7.T细胞清除肿瘤细胞。但是不同的肿瘤细胞会通过不同的方法对人体的免疫应答存在抑制效应，从而逃避免疫细胞的杀伤，产生免疫抑制、免疫耐受，促进肿瘤的发生和进展，肿瘤细胞的这一特征被称作免疫逃避。肿瘤免疫治疗就是基于肿瘤的免疫逃避的特征，通过对免疫检查点的抑制，重新启动并维持肿瘤免疫应答，恢复机体免疫系统对肿瘤的杀伤效果。这种疗法是一种基于人体自身免疫系统的新型肿瘤治疗手段，具有效果显著、疗效长期、副作用小等优点，是新一代的肿瘤治疗手段。近年来针对肿瘤免疫检查点的抗体类药物在临床中针对黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤等多种肿瘤中表现出强大的治疗潜力，有望实质性改善患者总生存期。常见的免疫检查点包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、OX40、ICOS、4-1BB等。PD-1(程序性死亡蛋白-1)，主要表达于激活的T细胞/B细胞上，是肿瘤免疫治疗的热门靶点之一，目前已上市的单抗抑制剂有美国FDA批准上市的纳武单抗(Nivolumab)和帕姆单抗(Pembrolizumab)，用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌等适应症。PD-1的配体PD-L1(程序性死亡蛋白配体-1)在抗原呈递细胞等多种组织中表达，也可作为肿瘤免疫治疗的靶点，目前美国FDA批准上市的PD-L1抑制剂有阿特珠单抗(Atezolizumab)、度伐单抗(Durvalumab)和阿维单抗(Avelumab)。PD-1/PD-L1的结合介导T细胞活化的共抑制信号，抑制T细胞对肿瘤的杀伤效果。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原4)是表达于活化T细胞表面的蛋白，作用于免疫应答启动阶段，它的激活抑制T细胞的活化并减少记忆T细胞的生成，实现免疫逃避。目前两种CTLA-4抑制剂(伊匹单抗Ipilimumab和西木单抗Tremelimumab)获美国FDA批准上市，用于黑色素瘤治疗，及其他癌种的临床研究。LAG3(淋巴细胞活化基因3)分布于多种免疫细胞，LAG3信号的活化抑制T细胞的增殖与活化，并参与调节T细胞的免疫抑制功能。TIM-3(T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3)表达于活化的T细胞，树突状细胞表面，激活的TIM-3通过多种方式抑制T细胞的免疫应答，在肿瘤的免疫逃避中起到重要作用。目前已有多个针对LAG3，TIM-3的抑制剂药物进行临床或临床前研究，可能会对多种肿瘤患者的治疗具有积极的作用。然而根据临床数据显示，PD-1/PD-L1肿瘤免疫检查点抑制剂的治疗中，只有少部分患者群体有响应，而且对于不同适应症很大。例如在霍奇金淋巴瘤中有效率接近90％，但在肺癌中仅对约30％的患者有效，即使病人肿瘤组织中PD-1/PD-L1阳性，有效率也仅提高至50％。由于目前认为免疫检查点抑制剂的响应程度不仅与肿瘤组织中免疫检查点蛋白表达水平有关，还与肿瘤组织中免疫细胞浸润有关，而且肿瘤组织中免疫细胞群体具有高度异质性，因此在采用肿瘤免疫治疗时，对患者肿瘤组织样本中的免疫细胞群体进行单细胞分析，对于临床中不同治疗手段的选择具有指导意义，对于提高治疗手段的精确性，最大化治疗效果，最小化副作用，节约治疗成本以及指导联合用药具有十分重要的作用。目前肿瘤免疫治疗中对免疫检查点蛋白表达及免疫细胞的分析手段主要有免疫组织化学法(IHC)或者基于高通量测序技术(NGS)的基因检测法，通过对患者肿瘤活检组织中的相关蛋白(如PD-L1)表达水平进行检测，以此对患者应用免疫疗法的响应程度进行预测。然而由于癌组织中细胞具有高度异质性，IHC法无法从单细胞水平进行检测，肿瘤组织中免疫检查点的总体表达水平与临床响应程度并不完全一致，且IHC法存在抗体识别表位不均一，阳性阈值难以确定的缺陷，预测结果相关性不高；而且无法同时检测多种靶标，无法在珍贵的肿瘤活检样本中对多个肿瘤免疫靶标进行同时检测。另外，基于高通量测序的基因检测法虽然可以做到单细胞水平多种靶标基因的检测，克服肿瘤细胞的异质性特点，但是基因水平的检测属于间接方式，是基于基因变异程度对药物临床响应情况的概率性预测，而基因水平的差异与蛋白水平或者细胞表型水平的差异并不具有完全的相关性，因此具有较高的假阳性率和假阴性率；而且检测结果中存在大量未知功能的突变，海量的信息对数据处理的要求非常高；此外其成本较高，不便进行多次动态监测以对肿瘤预后进行评估。质谱流式系统是一种新型的流式分析系统，其利用质谱原理来实现单细胞多参数检测的流式技术。其检测原理为通过金属元素标记的抗体对细胞进行染色，通过质谱检测器分析金属元素的含量从而对单个细胞多种蛋白水平进行分析，具有通道多，分析速度快，灵敏度高的特点。因此，基于质谱流式技术对肿瘤免疫治疗的单细胞分析手段具有十分显著的优势，拟进一步研究开发。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种新的肿瘤免疫治疗的检测技术，针对肿瘤相关免疫细胞高度异质性的特点，在单细胞水平对所有类型的免疫细胞进行检测，同时，针对多个肿瘤免疫靶点在蛋白水平进行高通量分析，极大提升检测结果与临床响应的相关性，提高肿瘤免疫治疗的精确性。本专利技术提供了一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法。本专利技术的方法包括以下步骤：(1)收集肿瘤患者的癌组织活检样本或血液样本进行处理，制备单细胞悬液；(2)利用金属元素标记的抗体对上述重悬的单细胞悬液同时进行多靶点标记；(3)将标记好的单细胞样品通过质谱流式系统进行检测；(4)基于所得到的质谱流式检测数据，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析，定量分析肿瘤免疫靶点在不同亚群细胞中的表达水平。通过本专利技术的检测，可以构建信息学分析模型，基于机器学习算法建立量化分析标准，对肿瘤单细胞特征与肿瘤免疫治疗响应程度之间的相关性进行定量分析。本专利技术方法所述步骤(1)中肿瘤活检样本通过消化或解离的方式制备成单细胞悬液，或者血液样本离心、过滤后重悬制成单细胞悬液；在上述单细胞悬液中加入红细胞裂解液，离心去除红细胞；单细胞悬液加入1/10体积的16％甲醛溶液，室温(25℃)固定10分钟；500g，4℃离心5分钟，弃去上清，加入1mL染色缓冲液(含有0.5％的牛血清白蛋白及0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液)清洗细胞，离心弃去上清，重复2遍，并用0.5mL染色缓冲液重悬细胞；进一步地，所述肿瘤单细胞悬液中加入含有0.5％的牛血清白蛋白及0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液配制的、带有金属元素标签标记的、用于免疫细胞分型的抗体和识别肿瘤免疫检查点的抗体的染色缓冲液，所述免疫分型的抗体选自识别CD45(免疫细胞分化抗原簇45)、CD3、CD4、CD8、CD14、CD16、CD20、CD56、HLA-DR(人类白细胞DR抗原)的抗体；所述肿瘤免疫检查点的抗体选自识别CD279、P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)收集肿瘤患者的癌组织活检样本或血液样本进行处理，制备单细胞悬液；(2)利用金属元素标记的抗体对上述重悬的单细胞悬液同时进行多靶点标记；(3)将标记好的单细胞样品通过质谱流式系统进行检测；(4)基于所得到的质谱流式检测数据，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析，定量分析肿瘤免疫检查点蛋白在不同亚群细胞中的表达水平；(5)经过数据处理和降维算法计算后，绘制二维散点图、SPADE图或热图，进行可视化数据展示；构建信息学分析模型，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析。

【技术特征摘要】
1.一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)收集肿瘤患者的癌组织活检样本或血液样本进行处理，制备单细胞悬液；(2)利用金属元素标记的抗体对上述重悬的单细胞悬液同时进行多靶点标记；(3)将标记好的单细胞样品通过质谱流式系统进行检测；(4)基于所得到的质谱流式检测数据，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析，定量分析肿瘤免疫检查点蛋白在不同亚群细胞中的表达水平；(5)经过数据处理和降维算法计算后，绘制二维散点图、SPADE图或热图，进行可视化数据展示；构建信息学分析模型，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析。2.根据权利要求1所述的一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法，其特征在于，所述步骤(1)肿瘤活检样本通过消化或解离的方式制备成单细胞悬液，或者血液样本离心、过滤后重悬制成肿瘤单细胞悬液；在所述单细胞悬液中加入红细胞裂解液，离心去除红细胞；于肿瘤单细胞悬液加入其1/10体积的16％甲醛溶液，25℃固定10分钟；用1mL染色缓冲液清洗细胞，重复2遍，并用0.5mL的染色缓冲液重悬肿瘤单细胞；所述染色缓冲液含有0.5％的牛血清蛋白及0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液。3.根据权利要求1所述的一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法，其特征在于，所述步骤(2)肿瘤单细胞悬液中加入含有0.5％的牛血清白蛋白及0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液配制的、带有金属元素标签标记的、用于免疫细胞分型的抗体和识别肿瘤免疫检查点的抗体的染色缓冲液，所述免疫分型的抗体选自识别CD45、CD3、CD4、CD8、CD14、CD16、CD20、CD56、HLA-DR；所述肿瘤免疫检查点的抗体选自识别CD279、PD-L1、CD152、CD223、CD366、CD278、CD134、CD137、CD95、CD80、VISTA、CD272、TIGIT、CD357、CD27、CD28、IDO、CD48或CD154的抗体，室温25℃混合孵育30分钟。4.根据权利要求1所述的一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法，其特征在于，所述步骤(2)用于作为抗体标签的金属...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏然，王宇翀，孙双午，
申请(专利权)人：上海宸安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31