【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及生物技术。具体涉及抗原受体检测试剂，尤其涉及一种嵌合抗原受体检测试剂及其制备与应用。
技术介绍
1、gideon gross(以色列weizmann研究所zelig eshhar教授实验室)和他的同事在1989年提出了嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)的概念(transplantproc.1989feb；21(1pt 1):127-30.；proc natl acad sci u s a.1989dec；86(24):10024-8.)，他们将抗体分子结合抗原的区域单链可变区(scfv)与分化抗原3分子ζ亚基(cd3ζ)或者免疫球蛋白fc段受体iγ(fcεriγ)的胞内部分融合形成嵌合抗原受体。嵌合抗原受体的基本结构包括识别抗原的结合区，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内免疫受体酪氨酸活化基序。嵌合抗原受体是嵌合抗原受体t细胞(car-t)治疗中嵌合抗原受体t细胞制剂的核心部件。而嵌合抗原受体的检测在car-t细胞治疗的研发，生产，质量控制，临床诊断与评价中具有至关重要的作用。
2、目前在临床或实验室被广泛使用的嵌合抗原受体的检测方法有以下几种：
3、(1)基因水平的检测。主要采用的方法有对脱氧核糖核酸进行实时定量链式聚合酶反应，数字链式聚合酶反应法，可以检测外源导入的嵌合抗原受体基因在目的细胞中的基因整合情况，但并不能反映出嵌合抗原受体基因的转录效率以及嵌合抗原受体蛋白的表达情况。
4、(2)转录水平的检测。主要采用核糖核酸测序法以及原
5、以上方法可以定量检测嵌合抗原受体信使核糖核酸(mrna)的丰度以及在目的细胞内的分布，但仍无法反映出嵌合抗原受体蛋白的表达情况。
6、(3)蛋白质水平的检测。采用的方法有荧光流式细胞术，化学发光法，免疫沉淀法和荧光显微镜法。这些方法可以直接检测嵌合抗原受体的表达情况，同时反映出嵌合抗原受体蛋白的功能。其中，嵌合抗原受体蛋白的检测方法依赖于多种不同的检测试剂，包括：
7、a.抗免疫球蛋白g多克隆抗体(poly clonal anti-igg abs)。这种抗体有很多种来源，具有各异的形态及性能，是目前被广泛使用的方法，具有成本低的优点，但是具有明显的缺点：特异性差，能够与多种非嵌合抗原受体的免疫球蛋白样分子结合，呈现假阳性。
8、b.蛋白l(protein l)。protein l是一种来自链球菌的蛋白，可以广泛地与各种类型的免疫球蛋白kappa链结合。这种方法也具有成本低的优点，但缺点是操作步骤繁琐，容易受到血清、培养基中免疫球蛋白的干扰，需要在染色中进行多次清洗以去除，而且在多指标检测中无法与其他抗体试剂共同使用。
9、c.独特性抗体(idiotype abs)。独特性抗体是可以特异性识别嵌合抗原受体可变区(scfv)部分的抗体。这种方法具有特异性好，稳定性高，可以与其他多种抗体试剂共同检测的优点，但这种专一性的试剂的缺点是开发难度高，目前仅有极少数特定的嵌合抗原受体可以使用独特性抗体进行检测。
10、因而，亟待研发特异性好和使用方便的嵌合抗原检测试剂，具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于，克服上述不足，提供一种特异性高，稳定性好，操作简单的蛋白水平检测嵌合抗原受体的检测试剂。
2、本专利技术提供一种嵌合抗原受体检测试剂。这种新型的嵌合抗原受体检测试剂可以用于高灵敏度、高特异性地检测嵌合抗原受体细胞中的嵌合抗原受体。
3、本专利技术所述嵌合抗原受体检测试剂由重组抗原蛋白，组装骨架和检测标签组成。
4、本专利技术所述的重组抗原蛋白为被待检测的嵌合抗原受体所结合的目标物。
5、其中，所述的重组抗原蛋白选自分化抗原19(cd19)、分化抗原20(cd20)、分化抗原22(cd22)、分化抗原30(cd30)、分化抗原38(cd38)、b细胞成熟抗原(bcma)、表皮生长因子受体(egfr)、间皮素(mesothelin)、神经节苷脂2(gd2)、人表皮生长因子受体-2(her2)、紧密连接蛋白18.2(claudin 18.2)或信号淋巴细胞活化分子(slam)。
6、本专利技术所述的重组抗原蛋白是含有生物素标记的。可以是经过化学方法共价修饰进行的非定点生物素标记，也可以是通过氨基酸序列中加入avi标签(一个15个氨基酸的短肽，glndifeaqkiewhe)进行的单定点生物素化修饰的。所述生物素标记的重组抗原蛋白，可以市售获得。
7、本专利技术所述嵌合抗原受体位于细胞的表面，所述细胞可以是任何来自于人体或者动物体内的原代细胞，特别是免疫细胞，更特别是淋巴细胞，也可以是能稳定复制传代的人来源或者动物来源的细胞株或细胞系。
8、所述细胞为构建在t淋巴细胞上的嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)、构建在自然杀伤细胞上的嵌合抗原受体自然杀伤细胞(car-nk细胞)、构建在自然杀伤t淋巴细胞上的嵌合抗原受体自然杀伤t淋巴细胞(car-nkt细胞)、构建在γδ型t淋巴细胞上的嵌合抗原受体γδt细胞(car-γδt细胞)或构建在巨噬细胞上的嵌合抗原受体巨噬细胞(car-m细胞)。
9、所述构建嵌合抗原受体细胞的方法可以是(1)通过直接基因转染技术构建，包括但不限于阳离子多聚物，脂质体复合物，壳聚糖聚合物，纳米离子，电转染等方法；(2)通过病毒载体，包括但不限于慢病毒，逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒等载体；(3)通过非病毒载体，包括但不限于piggybac转座子，睡美人(sb)转座子等载体。所述的蛋白和高分子聚合物结合的组装骨架为亲和素-聚乙二醇或链霉亲和素-葡聚糖。
10、本专利技术所述构建的嵌合抗原受体细胞为瞬时表达嵌合抗原受体的，或为基因组整合稳定表达嵌合抗原受体的。
11、本专利技术所述的组装骨架为一种蛋白组装骨架或为一种高分子聚合物组装骨架。所述的组装骨架能稳定的将多个重组抗原蛋白固定在一起，组装成稳定的复合物。
12、所述的蛋白和高分子聚合物结合的组装骨架为亲和素-聚乙二醇或链霉亲和素-葡聚糖。所述的组装骨架，可以通过共价的或非共价的方法连接。文献(astreptavidinmutant useful for directed immobilization on solid surfaces,gabriel o.reznik等，bioconjugate chem.2001)。
13、所述的蛋白组装骨架，其中的蛋白选自亲和素(avidin)、链霉亲和素(streptavidin)、中性亲和素(neutravidin)或基于以上蛋白改造的蛋白。
14、所述的高分子聚合物组装骨架，其中的高分子聚合物选自聚乙二醇(peg)、葡聚糖(dextran)、壳聚糖(chitosan)、多肽(peptide)、脱氧核糖核酸(dna)、或核糖核酸(rna)的两种或多种高分子本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体检测试剂，其特征在于，所述嵌合抗原受体检测试剂由重组抗原蛋白，组装骨架和检测标签组成。
2.根据权利要求1所述一种嵌合抗原受体检测试剂，其特征在于，所述的重组抗原蛋白选自分化抗原19、分化抗原20、分化抗原22、分化抗原30、分化抗原38、B细胞成熟抗原、表皮生长因子受体、间皮素、神经节苷脂2、人表皮生长因子受体-2、紧密连接蛋白18.2或信号淋巴细胞活化分子。
3.根据权利要求1所述一种嵌合抗原受体检测试剂，其特征在于，所述的组装骨架为一种蛋白组装骨架或为一种高分子聚合物组装骨架；所述的组装骨架能稳定的将多个重组抗原蛋白固定在一起，组装成稳定的复合物；或为所述蛋白和高分子聚合物结合的组装骨架；所述的蛋白组装骨架，其中的蛋白选自亲和素、链霉亲和素、中性亲和素或基于以上蛋白改造的蛋白；优选自链霉亲和素蛋白或基于链霉亲和素蛋白改造的蛋白。
4.根据权利要求3所述一种嵌合抗原受体检测试剂，其特征在于，所述的高分子聚合物组装骨架，其中的高分子聚合物选自聚乙二醇、葡聚糖、壳聚糖、多肽、脱氧核糖核酸、或核糖核酸的两种或多种高分子聚合物的
5.根据权利要求1所述一种嵌合抗原受体检测试剂，其特征在于，所述检测标签为通过适配检测仪器或者设备定量检测的标记物；所述标记为荧光素或荧光蛋白，用于荧光流式细胞仪法或者荧光显微镜法检测；或所述标记为金属同位素标签，用于质谱流式细胞仪法检测。
6.根据权利要求5所述一种嵌合抗原受体检测试剂，其特征在于，所述的金属同位素标签为具有不同质荷比的金属元素的稳定同位素：Y89、Pd102、Pd104、Pd105、Pd106、Pd108、Pd110、Cd106、Cd108，Cd110、Cd111、Cd112、Cd113、Cd114、Cd116、In113、In115、La139、Ce140、Pr141、Nd142、Nd143、Nd144、Nd145、Nd146、Nd148、Nd150、Sm147、Sm149、Sm152、Sm154、Eu151、Eu153、Gd155、Gd156、Gd157、Gd158、Gd160、Tb159、Dy161、Dy162、Dy163、Dy164、Ho165、Er166、Er167、Er168、Er170、Tm169、Yb171、Yb172、Yb173、Yb174、Yb176、Lu175或Bi209中的一种或多种组合。
7.根据权利要求6所述一种嵌合抗原受体检测试剂，其特征在于，所述的金属同位素标签优选镧系金属元素的同位素：La139、Ce140、Pr141、Nd142、Nd143、Nd144、Nd145、Nd146、Nd148、Nd150、Sm147、Sm149、Sm152、Sm154、Eu151、Eu153、Gd155、Gd156、Gd157、Gd158、Gd160、Tb159、Dy161、Dy162、Dy163、Dy164、Ho165、Er166、Er167、Er168、Er170、Tm169、Yb171、Yb172、Yb173、Yb174、Yb176或Lu175中的一种或多种组合。
8.根据权利要求6或7所述一种嵌合抗原受体检测试剂，其特征在于，所述金属元素的同位素选自1-10种，优选2-6种，更优选2-3种进行组合，每一种组合分别标记一种对应的嵌合抗原受体。
9.制备金属同位素标记的链霉亲和素的方法，该方法包括下列步骤：
10.如权利要求1所述一种嵌合抗原受体检测试剂的应用，其特征在于，所述应用为嵌合抗原受体检测试剂在嵌合抗原受体细胞疗法中检测嵌合抗原受体的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体检测试剂，其特征在于，所述嵌合抗原受体检测试剂由重组抗原蛋白，组装骨架和检测标签组成。
2.根据权利要求1所述一种嵌合抗原受体检测试剂，其特征在于，所述的重组抗原蛋白选自分化抗原19、分化抗原20、分化抗原22、分化抗原30、分化抗原38、b细胞成熟抗原、表皮生长因子受体、间皮素、神经节苷脂2、人表皮生长因子受体-2、紧密连接蛋白18.2或信号淋巴细胞活化分子。
3.根据权利要求1所述一种嵌合抗原受体检测试剂，其特征在于，所述的组装骨架为一种蛋白组装骨架或为一种高分子聚合物组装骨架；所述的组装骨架能稳定的将多个重组抗原蛋白固定在一起，组装成稳定的复合物；或为所述蛋白和高分子聚合物结合的组装骨架；所述的蛋白组装骨架，其中的蛋白选自亲和素、链霉亲和素、中性亲和素或基于以上蛋白改造的蛋白；优选自链霉亲和素蛋白或基于链霉亲和素蛋白改造的蛋白。
4.根据权利要求3所述一种嵌合抗原受体检测试剂，其特征在于，所述的高分子聚合物组装骨架，其中的高分子聚合物选自聚乙二醇、葡聚糖、壳聚糖、多肽、脱氧核糖核酸、或核糖核酸的两种或多种高分子聚合物的复合聚合物。
5.根据权利要求1所述一种嵌合抗原受体检测试剂，其特征在于，所述检测标签为通过适配检测仪器或者设备定量检测的标记物；所述标记为荧光素或荧光蛋白，用于荧光流式细胞仪法或者荧光显微镜法检测；或所述标记为金属同位素标签，用于质谱流式细胞仪法检测。
6.根据权利要求5所述一种嵌合抗原受体检测试剂，其特征在于，所述的金属同位素标签为具有不同质荷比的金属元素的稳定同位素：y89、pd102、pd104、pd105、pd106、pd108、pd110、cd106、cd108，cd110、cd111、cd112、cd113、cd1...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏然，孙双午，王宇翀，
申请(专利权)人：上海宸安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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