用于微管蛋白β-3链(TUBB3)蛋白的SRM/MRM测定制造技术

本公开提供了特定肽，以及来自微管蛋白β‑3链蛋白(TUBB3)的肽的衍生电离特征，特别有利于通过选择反应监测(SRM)质谱在福尔马林中固定的生物样品中直接定量TUBB3蛋白。使用Liquid Tissue试剂和方案从生物样品制备蛋白质样品，并通过样品的SRM/MRM质谱分析对TUBB3蛋白进行定量，其中特定肽被定量。本公开提供了治疗方法，其中将患者肿瘤样品中TUBB3的测量水平与参考水平进行比较，并且当测量的TUBB3水平低于参考水平时，用基于紫杉烷的治疗方案治疗患者。合适的参考水平例如是约700amol/μg组织。

SRM/MRM determination of tubulin beta-3 chain (TUBB3) protein

The present disclosure provides specific peptides, as well as derivative ionization characteristics of peptides derived from tubulin beta 3 chain protein (TUBB3), which are particularly conducive to the direct quantification of TUBB3 protein in formalin-fixed biological samples by selective reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Protein samples were prepared from biological samples using liquid Tissue reagents and schemes, and TUBB3 protein was quantified by SRM/MRM mass spectrometry, in which specific peptides were quantified. The present disclosure provides a treatment method in which the TUBB3 measurement level in a patient's tumor sample is compared with the reference level, and when the TUBB3 measurement level is below the reference level, the patient is treated with a paclitaxel-based treatment regimen. The appropriate reference level is, for example, about 700 amol/ug tissue.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于微管蛋白β-3链(TUBB3)蛋白的SRM/MRM测定本申请要求于2016年9月7日提交的美国临时申请NO.62/384,202和于2016年9月30日提交的62/402,984的优先权，二者标题均为用于微管蛋白β-3链(TUBB3)蛋白的SRM/MRM测定，其全部内容通过引用整体并入本文。
技术介绍
用一些治疗剂对癌症进行治疗，这些治疗剂以多种方式起作用以杀死正在生长和分裂的细胞。一组常见的化学治疗剂已经使用了数十年，无论是单独使用还是组合使用，并已成为临床肿瘤学实践中的传统和常规癌症治疗方法。这些药物通常通过杀死所有快速分裂的细胞而起作用，快速分裂是大多数癌细胞的主要特性之一。然而，这些试剂也杀死正在生长的正常细胞，因此并不被认为是杀死癌细胞的“靶向”方法。近年来，已经开发了大量癌症疗法，其特异性地仅针对癌细胞，其中治疗剂特异性攻击仅由癌细胞而非正常细胞表达的蛋白质。该方法被认为是癌症治疗的“靶向”方法。最近，另一种以“靶向”方式杀死癌细胞的方法是特异性调节免疫系统，以增强癌症患者免疫系统杀死癌细胞的能力。靶向微管蛋白β-3链(“TUBB3”)的治疗剂在早期临床试验中显示出前景。然而，只有癌细胞表达大量TUBB3蛋白的患者最有可能从这些TUBB3靶向治疗剂的治疗中受益。本文描述的方法提供基于定量蛋白质组学的测定，其递送TUBB3信号途径的活化的相关测量，这是因为TUBB3通常不在正常组织和/或正常上皮细胞中表达。特别地，该方法提供质谱测定，其定量来自癌症患者的福尔马林固定组织中的TUBB3，并且进一步使得能够改善癌症治疗的治疗决策。提供了衍生自TUBB3的亚序列的特定肽。该肽的肽序列和片段化/跃迁离子(transitionion)可用于基于质谱的选择反应监测(SRM)测定，其也可称为多反应监测(MRM)测定，并且在本文中称为SRM/MRM。描述了该肽用于TUBB3蛋白的SRM/MRM定量分析的用途。该SRM/MRM测定可用于测量来自TUBB3蛋白的特定肽的相对或绝对定量水平，并提供通过质谱测量从生物样品获得的给定蛋白质制剂中TUBB3蛋白的量的方法。更具体地，SRM/MRM测定可以直接测量从患者组织样品(例如福尔马林固定的癌症患者组织)中获得的细胞制备的复杂蛋白质裂解物样品中的肽。从福尔马林固定的组织制备蛋白质样品的方法描述于美国专利No.7,473,532中，其内容通过引用整体并入本文。美国专利No.7,473,532中描述的方法可以方便地使用得自ExpressionPathologyInc.(Rockville，MD)的LiquidTissue试剂和方案进行。来自癌症患者的组织的最广泛可用形式是福尔马林固定石蜡包埋的组织。手术切除的组织的甲醛/福尔马林固定是迄今为止全世界范围内保存癌组织样品的最常用方法，并且是标准病理学实践的公认惯例。甲醛水溶液称为福尔马林。“100％”福尔马林由在水中的饱和甲醛溶液(约40体积％或37质量％)组成，和少量稳定剂(通常为甲醇)以限制氧化和聚合度。保存组织的最常见方式是将整个组织长时间(8小时至48小时)浸泡在甲醛水溶液，通常称为10％中性缓冲福尔马林中，然后将固定的整个组织包埋在石蜡中，在室温下长期储存。因此，分析福尔马林固定癌组织的分子分析方法可用于分析癌症患者组织。来自SRM/MRM测定的结果可用于关联患者或受试者的特定组织样品(例如，癌症组织样品)中的TUBB3蛋白的准确和精确定量水平，所述组织(生物样品)从所述患者和受试者中收集并保存。这不仅提供关于癌症的诊断信息，而且还允许医师或其他医疗专业人员确定对患者的适当治疗。这种提供关于患病组织或其他患者样品中蛋白质表达水平的诊断和治疗重要信息的测定被称为伴随诊断测定(companiondiagnosticassay)。例如，可以设计这样的测定以诊断癌症的阶段或程度并确定患者最可能响应的治疗剂。
技术实现思路
本专利技术提供了测定福尔马林固定组织的人生物样品中人TUBB3蛋白水平的方法，包括检测并有利地使用质谱定量从人生物样品制备的蛋白质消化物中TUBB3片段肽的量；并计算样品中TUBB3蛋白的水平；其中TUBB3片段肽是SEQIDNO：1，并且其中所述水平是相对水平或绝对水平。可以在检测和/或定量TUBB3片段肽的量之前分离(fractionate)蛋白质消化物。所述蛋白质消化物可以含有蛋白酶消化物，而所述组织可以是石蜡包埋组织，例如从肿瘤获得的组织。可以通过比较一种生物样品中TUBB3片段肽的量与其他独立生物样品中相同TUBB3片段肽的量来定量TUBB3片段肽。还可以通过与已知量的添加内标肽进行比较来定量TUBB3片段肽，其中将生物样品中的TUBB3片段肽与具有相同氨基酸序列的内标肽进行比较；并且所述内标肽是同位素标记的肽。检测和/或定量蛋白质消化物中TUBB3片段肽的量可用于指示存在修饰的或未修饰的TUBB3蛋白以及与受试者体内癌症的关联。检测和/或定量TUBB3片段肽的量的结果或TUBB3蛋白的水平可以与癌症的诊断阶段/等级/状态相关联。将所述检测和/或定量所述TUBB3片段肽的量的结果或所述TUBB3蛋白的水平与癌症的诊断阶段/等级/状态相关联可以与以多重形式检测和/或定量其他蛋白质或来自其他蛋白质的肽的量相结合，以提供关于癌症的诊断阶段/等级/状态的额外信息。在如上所述测量人TUBB3的水平后，所述生物样品获自其的患者可以用治疗有效量的治疗剂进行治疗，其中所述治疗剂和/或治疗剂的施用量基于所述TUBB3片段肽的量或TUBB3蛋白的水平。所述治疗剂可以例如结合TUBB3蛋白和/或抑制其生物活性。还提供了治疗患有癌症的患者的方法，包括定量从患者获得的肿瘤样品制备的蛋白质消化物中特定TUBB3片段肽(例如SEQIDNO：1的肽)的水平，并且使用质谱通过选择反应监测计算所述样品中TUBB3肽的水平，将所述TUBB3片段肽的水平与参考水平进行比较，以及或者(i)当TUBB3片段肽的水平低于所述参考水平时，用基于紫杉烷的化疗方案治疗患者；或者(ii)当TUBB3片段肽的水平高于所述参考水平时，用不含有效量紫杉烷的治疗方案治疗患者。所述参考水平可以是例如700amol/μg+/-250amol/μg，+/-150amol/μg，+/-100amol/μg，+/-50amol/μg或者+/-25amol/μg的被分析的生物样品蛋白。所述生物样品的蛋白质消化物可以通过LiquidTissue方案制备，并且可以包含蛋白酶消化物，例如胰蛋白酶消化物。所述患有癌症的患者可能患有胃癌，当TUBB3水平低于截止值(cutoff)时，所述患者可以用FOLFIRI进行治疗，然后用多西紫杉醇(docetaxel)和顺铂(cisplatin，CDDP)进行治疗，或者当TUBB3水平高于截止值时，可以用FOLFIRI或5-FU加亚叶酸(folimicacid)(甲酰四氢叶酸(leucovorin))治疗。所述患有癌症的患者可能患有三阴性乳腺癌，当TUBB3水平低于截止值时，可以用ACT(蒽环类(anthracycline)和环磷酰胺(Cytoxan)，随后是是紫杉烷(taxane))进行治疗，或者当TUBB3水平高于截止值时，可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.福尔马林固定组织的人生物样品中人TUBB3蛋白水平的测量方法，包括使用质谱检测和/或定量从所述人生物样品制备的蛋白质消化物中TUBB3片段肽的量；并计算所述样品中TUBB3蛋白的水平；其中所述TUBB3片段肽是SEQ IDNO：1，并且其中所述水平是相对水平或绝对水平。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.07 US 62/384,202;2016.09.30 US 62/402,9841.福尔马林固定组织的人生物样品中人TUBB3蛋白水平的测量方法，包括使用质谱检测和/或定量从所述人生物样品制备的蛋白质消化物中TUBB3片段肽的量；并计算所述样品中TUBB3蛋白的水平；其中所述TUBB3片段肽是SEQIDNO：1，并且其中所述水平是相对水平或绝对水平。2.权利要求1的方法，还包括在检测和/或定量所述TUBB3片段肽的量之前分离所述蛋白质消化物的步骤。3.权利要求1的方法，其中所述蛋白质消化物包含蛋白酶消化物。4.权利要求1的方法，其中所述组织是石蜡包埋组织。5.权利要求1的方法，其中所述组织获自肿瘤。6.权利要求1的方法，还包括定量所述TUBB3片段肽。7.权利要求6的方法，其中定量所述TUBB3片段肽包括将一种生物样品中所述TUBB3片段肽的量与其他独立生物样品中相同TUBB3片段肽的量进行比较。8.权利要求7的方法，其中定量所述TUBB3片段肽包括通过与已知量的添加内标肽进行比较来确定生物样品中所述TUBB3片段肽的量，其中将生物样品中的所述TUBB3片段肽与具有相同氨基酸序列的内标肽进行比较，以及其中所述内标肽是同位素标记的肽。9.权利要求1的方法，其中检测和/或定量蛋白质消化物中所述TUBB3片段肽的量指示了存在修饰的或未修饰的TUBB3蛋白以及与受试者体内癌症的关联。10.权利要求9的方法，还包括将所述检测和/或定量所述TUBB3片段肽的量的结果或所述TUBB3蛋白的水平与癌症的诊断阶段/等级/状态相关联。11.权利要求10的方法，其中所述将所述检测和/或定量所述TUBB3片段肽的量的结果或所述TUBB3蛋白的水平与癌症的诊断阶段/等级/状态相关联与以多重形式检测和/或定量其他蛋白质或来自其他蛋白质的肽的量相结合，以提供关于癌症的诊断阶段/等级/状态的额外信息。12.权利要求1的方法，还包括向所述生物样品获自其的患者施用治疗有效量的癌症治疗剂，其中所述治疗剂和/或治疗剂的施用量基于所述TUBB3片段肽的量或TUBB3蛋白的水平。13.权利要求1的方法，其中治疗剂结合TUBB3蛋白和/或抑制其生物活性。14.治疗患有癌症的患者的方法，包括：(a)定量从所述患者获得的肿瘤样品制备的蛋白质消化物中特定TUBB3片段肽的水平，并且使用质谱通过选择反应监测计算所述样品中TUBB3肽的水平；(b)将所述TUBB3片段肽的水平与参考水平进行比较，和(c)当TUBB3片段肽的水平低于所述参考水平时，用基于紫杉烷的化疗方案治疗患者，或者(d)当TUBB3片段肽的水平高于所述参考水平时，用不含有效量紫杉烷的治疗方案治疗患者。15.权利要求14的方法，其中所述参考水平为700amol/μg+/-250amol/μg的被分析的生物样品蛋白。16.权利要求14的方法，其中所述参考水平为700amol/μg+/-150amol/μg的被分析的生物样品蛋白。17.权利要求14的方法，其中所述参考水平为700amol/μg+/-100amol/μg的被分析的生物样品蛋白。18.权利要求14的方法，其中所述参考水平为700amol/μg+/-50amol/μg的被分析的生物样品蛋白。19.权利要求14的方法，其中所述参考水平为700amol/μg+/-25amol/μg的被分析的生物样品蛋白。20.权利要求14-19中任一项的方法，其中所述生物样品的所述蛋白质消化物通过LiquidTissue方案进行制备。21.权利要求14-20中任一项的方法，其中所述蛋白质消化物包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：托德·亨布罗，法比奥拉·塞奇，沙力特·施瓦兹，
申请(专利权)人：爱科谱迅病理研究公司，
类型：发明
国别省市：美国,US