一种犬瘟热病毒抗体荧光检测试纸条及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种犬瘟热病毒抗体荧光检测试纸条及其制备方法和应用。本发明专利技术所提供的试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫及底板，所述结合物释放垫a上喷涂有鸡抗犬抗抗体‑生物素偶联物，所述结合物释放垫b上喷涂有链霉亲和素‑荧光微球标记物，所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线上包被有犬瘟热病毒N表达蛋白，所述质控线上包被有羊抗鸡抗抗体。本发明专利技术的试纸条具有灵敏度高、特异性强、操作简单、经济实用等优点，可实现犬瘟热病毒抗体现场快速定量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种犬瘟热病毒抗体荧光检测试纸条及其制备方法和应用
本专利技术涉及犬瘟热病毒抗体的检测，具体涉及一种犬瘟热病毒抗体荧光检测试纸条及其制备方法和应用。技术背景犬瘟热(CanineDistemper，CD)是由犬瘟热病毒(CanineDistemperVirus，CDV)感染引起的一种急性、高度接触性传染病，是对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护危害最大的疫病之一。CDV属于副粘病毒科麻疹病毒属，是负链单股不分节的RNA病毒。CDV主要由核衣壳蛋白N、磷蛋白P、基质膜蛋白M、融合蛋白F、附着或血凝蛋白H、大蛋白L等6种蛋白组成，其中核衣壳蛋白N、融合蛋白F以及血凝蛋白H是犬免疫系统的主要目的抗原，是产生中和抗体的重要抗原。核衣壳蛋白N是保守性较强的免疫原性蛋白，除含B细胞表位，还含有T细胞表位，在犬瘟热感染的早期免疫应答中起主要作用，能引起强烈的抗体反应。犬瘟热病毒病主要是通过疫苗预防，而疫苗免疫动物与感染动物体内都会产生结构蛋白抗体，因此检测结构蛋白抗体的诊断方法能确定动物对病毒株的抵抗力。同时日常监测疫苗产生抗体是对群体的日常监测选择疫苗、评估免疫程序合理性、掌握健康状态的重要手段，同时也可从侧面反映管理是否合理，也是适时注射疫苗的主要依据。目前已建立的用于检测CDV抗体的血清学方法主要有血凝抑制试验、中和试验、ELISA法及免疫胶体金法等。血凝抑制试验需要新鲜且敏感性高的红细胞，检测时间需要2～3h；中和试验操作繁琐，需要较高的试验条件和操作水平，整个试验需1～2周的时间才能出结果；ELISA方法操作要求高，需要酶标仪测定结果，且不适合做单个样本的检测；免疫胶体金法虽然检测方便，不需专业技术人员和工作环境，但其检测的灵敏度低，且只能定性，检测范围窄。这些都限制了它们在犬瘟热病毒抗体临床检测中的应用，因此，本专利技术专利的目的就是克服以上几种方法的缺点，建立一种操作简便、灵敏、特异、快速的犬瘟热病毒抗体定量检测方法，应用于犬瘟热病毒免疫效果的监测，从而限制犬瘟热病毒的流行。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种犬瘟热病毒抗体荧光检测试纸条。本专利技术所提供的犬瘟热病毒抗体荧光检测试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫及底板；所述结合物释放垫a上喷涂有鸡抗犬抗抗体-生物素偶联物；所述结合物释放垫b上喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物；所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线上包被有犬瘟热病毒N表达蛋白，所述质控线上包被有羊抗鸡抗抗体。所述结合物释放垫a上采用的鸡抗犬抗抗体为鸡抗犬IgG的IgY，所述硝酸纤维素膜上质控线采用的羊抗鸡抗抗体为羊抗鸡IgY的IgG。所述样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在所述底板上。本专利技术的另一个目的是提供一种上述犬瘟热病毒抗体荧光检测试纸条的制备方法，其包括步骤：1)制备具有包被有犬瘟热病毒N表达蛋白的检测线和包被有羊抗鸡抗抗体的质控线的硝酸纤维素膜；2)制备喷涂有鸡抗犬抗抗体-生物素偶联物的结合物释放垫a和喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物的结合物释放垫b；3)将样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在底板上。具体地说，步骤包括：1)犬瘟热病毒N蛋白的表达及纯化；2)将1)表达的犬瘟热病毒N蛋白包被在硝酸纤维素膜上构成检测线(T)，将市售的羊抗鸡抗抗体包被在硝酸纤维素膜上构成质控线(C)；3)将市售的鸡抗犬抗抗体-生物素偶联物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘干2h后取出，即为结合物释放垫a，置于干燥环境中保存备用；4)将链霉亲和素加入到已活化的荧光微球溶液中，制备链霉亲和素-荧光微球标记物；5)将4)制备的链霉亲和素-荧光微球标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘干2h后取出，即为结合物释放垫b，置于干燥环境中保存备用；6)将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白(BSA)、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h备用；7)将样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫依次按顺序粘贴在底板上，用机器切成3.95mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，2～30℃条件下可保存12个月。上述犬瘟热病毒抗体荧光检测试纸条在检测犬瘟热病毒抗体中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的犬瘟热病毒抗体荧光检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将鸡抗犬抗抗体-生物素偶联物和链霉亲和素-荧光微球标记物分别固定于两张结合物释放垫上，样品中的犬瘟热病毒抗体在流动过程中，先与结合物释放垫a上的鸡抗犬抗抗体-生物素偶联物结合，再通过生物素-链霉亲和素系统与结合物释放垫b上的链霉亲和素-荧光微球标记物结合，形成抗体-抗抗体-荧光微球复合物。样本中的抗体被硝酸纤维素膜检测线上的犬瘟热病毒N表达蛋白捕获，通过荧光层析分析仪定量检测样本中犬瘟热病毒抗体滴度。本专利技术的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，将荧光微球标记在链霉亲和素上，有效减少了标记荧光微球时可能产生的空间位阻，提高了抗原-抗体的结合效率，对提高检测灵敏度有较大帮助；并且通过生物素-链霉亲和素系统的多层次放大作用，在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰，还可降低操作误差，提高测定的精确度。本专利技术试纸条可实现犬瘟热病毒抗体现场快速检测，具有较高的实用价值和推广价值。附图说明图1为试纸条剖面结构示意图。图2为犬瘟热病毒抗体检测标准曲线图。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内可能会对本专利技术进行各种改动或修饰，这些改动或修饰同样应落入本专利技术的保护范围。实施例1：犬瘟热病毒抗体荧光检测试纸条的构成(图1)所述试纸条是由底板(8)、样品吸收垫(1)、结合物释放垫a(2)、结合物释放垫b(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(5)组成；所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫a(2)、结合物释放垫b(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(5)依次按顺序粘贴在PS底板(8)上；结合物释放垫a(2)从起始端有1/4区域被样品吸收垫(1)覆盖，结合物释放垫b(3)从起始端有1/4区域被结合物释放垫a(2)覆盖，结合物释放垫b(3)的末端与硝酸纤维素膜(4)的始端连接，硝酸纤维素膜(4)的末端与吸水垫(5)的始端相连，样品吸收垫(1)的始端与PS底板(8)的始端对齐，吸水垫(5)的末端与PS底板(8)的末端对齐；所述硝酸纤维素膜(4)上有检测线(6)和质控线(7)，检测线(T)和质控线(C)均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线(6)位于靠近结合物释放垫b(3)的末端的一侧；质控线(7)位于远离结合物释放垫b(3)的末端的一侧。将试纸条用机器切成3.95mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，2～30℃条件下可保存12个月。实施例2：实施例1中所述试纸条的制备该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：1)制备具有包被有犬瘟热病毒N表达蛋白的检测线和包被有羊抗鸡抗抗体的质控线的硝酸纤维素膜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种犬瘟热病毒抗体荧光检测试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫及底板，其特征在于：所述结合物释放垫a上喷涂有鸡抗犬抗抗体‑生物素偶联物；所述结合物释放垫b上喷涂有链霉亲和素‑荧光微球标记物；所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线上包被有犬瘟热病毒N表达蛋白，所述质控线上包被有羊抗鸡抗抗体。

【技术特征摘要】
1.一种犬瘟热病毒抗体荧光检测试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫及底板，其特征在于：所述结合物释放垫a上喷涂有鸡抗犬抗抗体-生物素偶联物；所述结合物释放垫b上喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物；所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线上包被有犬瘟热病毒N表达蛋白，所述质控线上包被有羊抗鸡抗抗体。2.根据权利要求1所述的犬瘟热病毒抗体荧光检测试纸条，其特征在于：所述结合物释放垫a上采用的鸡抗犬抗抗体为鸡抗犬IgG的IgY，所述硝酸纤维素膜上质控线采用的羊抗鸡抗抗体为羊抗鸡IgY的IgG。3.根据权利要求1-2任一所述的犬瘟热病毒抗体荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：何方洋，崔廷婷，王兆芹，龙光宗，鲁晓雄，刘二战，万宇平，贾芳芳，朱亮亮，冯才伟，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11