针对NOTCH通路蛋白的SRM/MRM分析制造技术

本发明专利技术属于癌症治疗领域，公开了一种测定福尔马林固定组织的生物样品中蛋白质水平的方法。具体地，本发明专利技术提供了使用质谱检测和定量生物样品中DLL1、DLL3、JAG1、JAG2、Notch1、Notch2、Notch3、Notch4和/或DLL4蛋白的方法，其中所述生物样品例如福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品。另外，还提供了基于生物样品中DLL1、DLL3、JAG1、JAG2、Notch1、Notch2、Notch3、Notch4和/或DLL4蛋白的水平治疗癌症的方法。本发明专利技术的方法可用于为例如癌症治疗作出更好的治疗决策。

SRM / MRM analysis of Notch pathway protein

【技术实现步骤摘要】
针对NOTCH通路蛋白的SRM/MRM分析相关申请的交叉引用本申请要求于2018年10月30日提交的美国临时专利申请62/752,842的优先权，该申请通过引用将其全部纳入本申请。
技术介绍
Notch信号通路在一些正常组织和各种癌症中驱动干细胞的增殖、分化、凋亡、细胞命运和维持。Notch信号通路在胚胎发育期间最活跃。Notch信号的异常激活在多种肿瘤类型中被描述，并且激活的Notch通路蛋白与癌症进展和治疗抗性相关。DLL1(也称为δ样蛋白1)是δ/锯齿蛋白家族的成员。它在造血过程中发挥着调节细胞命运决定的作用，并且可能在细胞间通讯中起作用。DLL1在许多癌症中过表达，并且针对DLL1功能的抑制剂正在开发用于癌症治疗。因此，能够定量肿瘤细胞中DLL1蛋白的分析方法用作癌症治疗方案的一部分是有用的，特别是，有关DLL1表达水平的信息可用于选择特定的治疗方法。DLL3(也称为Delta-like3)，其通常在神经发育的特定时间在胎儿脑中表达。在此期间，它通过与Notch和DLL1相互作用并将它们分别重新定向或保留至晚期内涵体/溶酶体室或高尔基体，从而阻止它们定位至细胞表面，进而抑制顺式和反式Notch通路激活。此外，DLL3是几种Notch配体之一，它们似乎是ASCL1蛋白的直接下游靶点。同时，这些观察结果提示DLL3可能与神经内分泌表型有关，并有助于神经内分泌肿瘤发生。已经开发了许多DLL3抑制剂，并且正在测试它们用于治疗神经内分泌肿瘤。DLL3蛋白的表达模式与肿瘤的鉴定和癌症治疗手段的选择有关，包括高级别肺神经内分泌肿瘤、小细胞肺癌(SCLC)和大细胞神经内分泌癌(LCNEC)的诊断和治疗。因此，能够定量肿瘤细胞中DLL3蛋白的分析方法用作癌症治疗方案的一部分是有用的，特别是，关于DLL3表达水平的信息可用于选择特定的治疗方法。JAG1(也称为Jagged1)是与哺乳动物Notch信号传导通路中的受体相互作用的细胞表面蛋白(配体)。Notch信号传导通路是高度保守的通路，其功能是在许多器官系统中建立和调节细胞命运决定。一旦JAG1-NOTCH(受体-配体)发生相互作用，则触发蛋白水解性裂解的级联反应，导致下游靶基因的转录激活，从而启动和促进癌症过程。已经开发了防止JAG1和其Notch受体之间相互作用的癌症治疗剂，因此，能够定量肿瘤细胞中的JAG1蛋白的测定方法可以用于选择癌症治疗的方法。JAG2(也称为Jagged2)是与哺乳动物Notch信号传导通路中的受体相互作用的细胞表面蛋白(配体)。JAG2最熟知的功能是与Notch2受体相互作用以激活Notch信号传导通路，其可导致癌症过程的起始和进展。已经开发了阻止JAG2和Notch2受体之间的相互作用的癌症治疗剂，因此，可以定量肿瘤细胞中的JAG2蛋白的测定方法可以用于选择癌症治疗的方法。Notch1、Notch2、Notch3和Notch4是具有重复的胞外EGF结构域和Notch(或DSL)结构域的跨膜蛋白家族。这些蛋白质参与胚胎发生中的侧向抑制，并且当异常表达时，会驱动癌细胞的生长。Notch信号传导网络是进化上保守的细胞间信号传导通路，其调节物理上相邻的细胞之间的相互作用。这种1型跨膜蛋白家族的成员具有相同的结构特征，包括由多个表皮生长因子样(EGF)重复组成的胞外结构域，和由多个不同的结构域类型组成的胞内结构域。这些蛋白质在反式高尔基体网络中被切割，并以异二聚体的形式呈递在细胞表面，在那里它们起到膜结合配体的受体功能，所述膜结合配体在血管、肾和肝发育中起作用。已经开发或正在开发多种Notch受体抑制剂作为靶向癌症治疗剂，因此，能够定量4种Notch受体中的一种的测定方法可以用于选择癌症治疗的方法。DLL4(也称为δ样经典Notch配体4)是一种作为Notch配体起作用的蛋白，其特征在于具有一个DSL结构域、EGF重复结构域和跨膜结构域。DLL4激活NOTCH1和NOTCH4。DLL4参与血管生成，并负调节内皮细胞增殖、迁移和血管生成萌发。DLL4对视网膜祖细胞增殖是必需的，并且是抑制晚期视网膜祖细胞中的视杆细胞死亡以及其它类型的视网膜细胞正常生成所必需的。DLL4的表达与驱动肿瘤过程有关，因此正在开发多种DLL4抑制剂。因此，能够定量肿瘤细胞中的DLL4蛋白的测定方法可以用于选择癌症治疗的方法。
技术实现思路
患者的肿瘤组织中涉及NOTCH信号传导通路的一种或多种蛋白质(包括DLL1、DLL3、JAG1、JAG2、Notch1、Notch2、Notch3、Notch4和/或DLL4)的蛋白质表达水平可以通过定量源自每种全长蛋白质的部分序列的肽来确定。可以使用质谱技术检测每种肽，例如基于质谱的选择反应监测(SRM)，也称为多重反应监测(MRM)，本专利技术称为SRM/MRM分析。SRM/MRM分析用于直接定量获自癌症患者组织的细胞中的片段肽的量，例如福尔马林固定的癌症组织。定量可以是相对的或绝对的。当需要绝对定量时，将每种肽的测量水平与已知量的具有与测量肽相同氨基酸序列的标记参考肽进行比较。所述肽对于特定蛋白质是独特的，因此，一个肽分子源自一个蛋白质分子，肽的摩尔量的测定提供了对其来源的蛋白质的摩尔量的直接测定。蛋白质表达的测量可用于癌症的诊断、癌症分期、癌症进展的预后、预测各种癌症治疗和疗法临床反应的可能性等。具体实施方式提供了基于蛋白质组学测定法的定量方法，所述方法用于定量来自癌症患者的福尔马林固定组织中的DLL1、DLL3、JAG1、JAG2、Notch1、Notch2、Notch3、Notch4和/或DLL4蛋白。这些测定的数据可用于为例如癌症治疗作出更好的治疗决策。SRM/MRM分析可用于测量从生物样品中获得的给定蛋白质制品中DLL1、DLL3、JAG1、JAG2、Notch1、Notch2、Notch3、Notch4和/或DLL4蛋白的肽的相对或绝对定量水平。更具体地，SRM/MRM分析可以直接测量从获自患者组织样品(例如福尔马林固定的癌症患者组织)所得到的细胞制备的复合蛋白裂解物样品中的这些肽。从福尔马林固定的组织制备蛋白质样品的方法描述于美国专利号7,473,532中，其内容通过引用整体合并到本专利技术中。美国专利7,473,532中描述的方法通过使用从ExpressionPathology公司(罗克维尔市，马里兰州)获得的LiquidTissue试剂和方案可以方便地进行实施。来自癌症患者组织的最广泛和最有利的组织形式是福尔马林固定的石蜡包埋组织。手术切除组织的甲醛/福尔马林固定是世界范围内保存癌组织样品的最常用方法，并且是标准病理学实践的公认惯例。甲醛水溶液称为福尔马林。"100％"福尔马林由甲醛(按体积约40％或按质量约37％)饱和水溶液组成，并含有少量稳定剂，通常为甲醇以限制氧化和聚合度。保存组织的最常用方法是将整个组织在甲醛水溶液中浸泡较长时间(8小时至48小时)，甲醛水溶液通常称为10％中性缓冲福尔马林，然后将固定的整个组织包埋在石蜡中以在室温下长期储存。因此，分析福尔本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定福尔马林固定组织的生物样品中蛋白质水平的方法，该方法包括：/n通过质谱检测和/或定量来自所述生物样品的蛋白质消化物中的一种或多种修饰或未修饰片段肽的量；以及计算所述样品中所述蛋白质的水平；/n其中所述蛋白质选自由以下各项组成的组中：DLL1蛋白、DLL3蛋白、JAG1蛋白、JAG2蛋白、Notch1蛋白、Notch2蛋白、Notch3蛋白、Notch4蛋白和DLL4蛋白。/n

【技术特征摘要】
20181030 US 62/752,8421.一种测定福尔马林固定组织的生物样品中蛋白质水平的方法，该方法包括：
通过质谱检测和/或定量来自所述生物样品的蛋白质消化物中的一种或多种修饰或未修饰片段肽的量；以及计算所述样品中所述蛋白质的水平；
其中所述蛋白质选自由以下各项组成的组中：DLL1蛋白、DLL3蛋白、JAG1蛋白、JAG2蛋白、Notch1蛋白、Notch2蛋白、Notch3蛋白、Notch4蛋白和DLL4蛋白。


2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在检测和/或定量所述一种或多种修饰或未修饰片段肽的量之前分离所述蛋白质消化物的步骤。


3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述分离步骤选自由以下各项组成的组中：液相色谱、纳米反相液相色谱、高效液相色谱和反相高效液相色谱。


4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质消化物包括蛋白酶消化物。


5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述蛋白质消化物包括胰蛋白酶消化物。


6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述质谱包括串联质谱、离子阱质谱、三重四级杆质谱、离子阱/四级杆混合质谱、MALDI-TOF质谱、MALDI质谱和/或飞行时间质谱。


7.根据权利要求6所述的方法，其中，所用的质谱的模式是选择反应监测(SRM)、多反应监测(MRM)、多选择反应监测(mSRM)和/或智能选择反应监测(iSRM)。


8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质是DLL1，且所述一种或多种片段肽是SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：2所示的肽。


9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质是DLL3，且所述一种或多种片段肽是SEQIDNO：3和/或SEQIDNO：4所示的肽。


10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质是JAG1，且所述一种或多种片段肽是SEQIDNO：5和/或SEQIDNO：6所示的肽。


11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质是JAG2，且所述一种或多种片段肽是SEQIDNO：7和/或SEQIDNO：8所示的肽。


12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质是Notch1，且所述一种或多种片段肽是SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：托德·哈姆布拉夫，法比奥拉·切基，S·施瓦兹，K·斯科特，
申请(专利权)人：爱科谱迅病理研究公司，
类型：发明
国别省市：美国;US