微管结合蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种微管结合蛋白及其编码基因与应用。本发明专利技术公开的微管结合蛋白，是如下（ａ）或（ｂ）的蛋白质：（ａ）由序列表中序列１所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（ｂ）将序列１的氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且与抑制ＭＣＡＫ蛋白解聚微管的活性相关的由序列１衍生的蛋白质。本发明专利技术的蛋白通过与ＥＢ１和ＭＣＡＫ的相互作用参与微管正向末端动态性的调控，通过抑制ＭＣＡＫ蛋白的微管解聚活性来稳定微管。将所述微管结合蛋白基因的小干扰ＲＮＡ的编码基因导入宿主，ＭＣＡＫ的微管定位将受到严重影响。本发明专利技术的蛋白及其编码基因将在医学及制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种微管结合蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
微管是高度动态性的纤维状细胞骨架结构，在细胞有丝分裂、细胞迁移、细胞极化 过程中均起到关键作用。微管的生长及收缩均是由一系列微管结合蛋白调控的。微管动态 性的失调将导致细胞无法精确的进行有丝分裂，危及生物体的生存与健康。微管结合蛋白中有一类蛋白特异结合在生长中的微管正向末端，如EB1/2/3， CLIP-115/170, CLASP1/2, pl50Glued, adenomatous polyposis coli(APC), MCAK, ACF7, LISLMelanophilin and STIMl。这些蛋白是如何组织起来并调控微管动态性还不为人知。 这些蛋白大多数都与EBl直接相互作用。EBl是EB家族的3个成员之一，属于一种微管末端结合蛋白，可以位于生长中的 微管的正端。EBl可能促进微管的“搜寻和捕获”，并与保持染色体的稳定性有关。研究表 明，EBl具有延长微管的作用，EBl的高表达表明能加强微管的稳定性。另外，有研究证明， EBl可以通过其C-端酪氨酸残基与CLIP170和CLIP115这两种微管末端结合蛋白发生相互 作用，当EBl过量表达而均勻的沿着微管分布时，将减慢胞质连接蛋白CLIPs (cytoplasmic linker protein)的分裂。APC(腺瘤性息肉蛋白)存在一个非常保守的EBl结合区域。EBl 蛋白在人类细胞中可以同APC蛋白发生相互作用，使APC结合到微管的末端。最近有研究 表明EBl可调节APC与β -catenin ( β -连接素)的相互作用。β -catenin是WNT信号通 路上的主要蛋白，而APC具有降低β-catenin的作用。当EBl高表达时，可能加强了 APC 与β -catenin的相互作用，促进了 β -catenin的降解，从而降低了胞浆中β -catenin的 浓度，WNT信号通路受阻，从而防止肿瘤的发生，在胚胎细胞中，APC的这种功能表现为胚胎 细胞分裂被抑制而导致染色体分离异常。从mRNA水平和蛋白水平对EBl在胚胎细胞/组织中的表达分析发现，EBl在染色体数目异常胚胎细胞/组织中的表达明显高于其在染色体数目正常的胚胎细胞/组织中的 表达。可以推测高表达的EBl指引微管向染色体方向生长的能力得到加强，微管附着到染 色体着丝粒的能力也得到加强，但由于纺锤体微管牵引染色体向细胞两极移动的过程是通 过纺锤体微管主动解聚，纺锤体微管缩短所至，因此当EBl表达增加，EBl稳定微管的作用 得到加强，此时微管不易被解聚，使染色体不能因为微管的牵引作用而向细胞的两极移动 (即细胞分裂后期延长)，导致细胞分裂障碍和染色体分离异常。MCAK蛋白(有丝分裂着丝点结合马达蛋白，Mitotic centromere-associated kinesin)是kinesin-13蛋白家族中的一员，它能通过ATP水解催化微管末端解聚，是一种 微管解聚酶。MCAK在体内以二聚体的形式存在，当MCAK高表达时，会造成微管解聚，染色 体不能正常分离。微管的体外聚合/解聚实验也表明，在ATP存在的条件下，当加入一定浓 度的MCAK蛋白时，微管的解聚速率提升了 100倍左右。另有研究显示反义寡核苷酸诱导的 MCAK低表达会导致部分染色体分离滞后，表明MCAK在有丝分裂过程中起到非常重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了 一种微管结合蛋白及其编码基因与应用。本专利技术提供的微管结合蛋白蛋白，名称为TIP150，来源于人，是 如下(a)或(b)的 蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且与抑制MCAK解聚微管的活性相关的由序列1衍生的蛋白质。序列表中的序列1由1368个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第862-988位氨 基酸残基为EBl结合区域，自N端第989-1368位氨基酸残基为coiled-coil结构域。所述一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指将序列1的EBl结合 区域和coiled-coil结构域外的氨基酸进行取代和/或缺失和/或添加。为了使(a)中的TIP150便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成 的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列<table>table see original document page 4</column></row><table>上述(b)中的TIP150可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述(b)中的TIP150的编码基因可通过将序列表中序列2自5'端第1至4107位核苷酸 所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的 错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述TIP150蛋白的编码基因(TIP150)也属于本专利技术的保护范围。所述TIP150蛋白的编码基因(TIP150)为如下1)或2)或3)的DNA分子1)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA分子。上述严格条件可为在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下 杂交并洗膜。序列表中的序列2由4107个脱氧核糖核苷酸组成，其编码序列为自5’末端第 1-4104位核苷酸，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’末端第 2584-2964位核苷酸编码EBl结合区域，自5，末端第2965-4104位核苷酸编码coiled-coil 结构域含有所述编码基因(TIP150)的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系及重组菌均 属于本专利技术的保护范围。可用现有的表达载体构建含有所述编码基因(TIP150)的重组表达载体。使用TIP150构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强 型启动子或组成型启动子；此外，使用本专利技术的基因构建重组表达载体时，还可使用增强 子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起 始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制 信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来 自转录起始区域或结构基因。本专利技术还保护扩增所述基因的引物。所述引物具体可为序列表中的序列3所示的核苷酸和序列表中的序列4所示的核苷酸。本专利技术还提供了一种抑制所述基因(TIP150)的表达的方法，是将抑制所述基因 的小干扰RNA导入宿主，从而抑制所述基因的表达。所述小干扰RNA具体可为正义链为序列表中的序列5、反义链为序列表中的序列6 的双链RNA。所述蛋白、所述基因可应用于制备抑制肿瘤增殖的药物和/或制备抑制MCAK蛋白 的解聚微管活性的药物。本专利技术还保护一种抑制MCAK蛋白的解聚微管活性和/或抑制肿瘤增殖的药本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白，是如下（ａ）或（ｂ）的蛋白质：　　（ａ）由序列表中序列１所示的氨基酸序列组成的蛋白质；　　（ｂ）将序列１的氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且与抑制ＭＣＡＫ蛋白解聚微管的活性相关的由序列１衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抑制MCAK蛋白解聚微管的活性相关的由序列1衍生的蛋白质。2.权利要求1所述蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白的编码基因为如下1)或2)或 3)的DNA分子1)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚雪彪，姜恺，王建宇，王志凯，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]