使用经掩蔽的半抗原在福尔马林固定石蜡包埋的组织中的蛋白质邻近测定制造技术

本申请公开了经掩蔽的半抗原和经掩蔽的半抗原‑抗体缀合物，其可用于能够检测样本中处于彼此邻近位置的靶标。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用经掩蔽的半抗原在福尔马林固定石蜡包埋的组织中的蛋白质邻近测定相关申请的交叉引用本申请要求2016年2月29日提交的美国临时专利申请第62/301,489号的申请日的权益，以及2015年8月28日提交的美国临时专利申请第62/211,590号的申请日的权益，其公开内容在此通过引用整体并入本申请。
所公开的实施方案涉及检测样本中的靶标(target)，包括位于样本近侧的靶标。所公开的实施方案还提供了使用经掩蔽的半抗原(cagedhapten)或经掩蔽的半抗原缀合物检测福尔马林固定石蜡包埋的组织中的蛋白质二聚体的邻近测定法(proximityassay)。工业实用性本申请在化学和诊断领域具有工业实用性。
技术介绍
免疫组织化学(IHC)是指使用对特定抗原具有特异性的抗体对生物样品中的抗原诸如蛋白质进行检测、定位和/或定量的方法。IHC提供了确切地识别特定蛋白质位于组织样品内何处的实质性优点。这也是检查组织本身的有效方式。原位杂交(ISH)是指检测、定位和定量核酸的方法。IHC和ISH两者均可在各种生物样品诸如组织(例如新鲜冷冻的、福尔马林固定的、石蜡包埋的组织)和细胞学样品上进行。靶标的识别可使用各种标记(例如，生色、荧光、发光，放射性测量标记)来检测，而不管靶标是核酸还是抗原。为了在临床环境中强有力地检测、定位和定量靶标，识别事件的扩增是期望的，因为确信检测低丰度细胞标志物的能力对于诊断目的变得越来越重要。例如，响应于单个抗原检测事件，在标志物位点沉积数百或数千个标记分子，通过扩增，增强了所述检测识别事件的能力。蛋白质-蛋白质相互作用网络是生物系统的标志。蛋白质-蛋白质相互作用形成信号通路，其调节正常细胞和癌细胞的细胞功能的各个方面。已经开发了用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法，诸如细胞外生长因子激活之后的瞬时受体酪氨酸激酶二聚化和复合物形成；然而，这些方法不是特别设计用于福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织。对于已知在癌症生物学中是重要决定因素的生物标志物而言，询问特定分子间相互作用的存在和分布的能力在新的诊断能力的背景下是高度感兴趣的并且用于确定药物开发背景下的治疗效果。在冷冻和石蜡包埋的组织上探测和记录分子相互作用分布的能力仍然无法获得；已经提出了解决这个问题的替代技术，尽管在实际使用中解决方案没有被证明是有效和可靠的。OLinkAB最近开发了邻近连接测定法。这是在福尔马林固定石蜡包埋的组织上原位检测蛋白质-蛋白质相互作用的唯一已知商业产品。邻近连接测定技术使用DNA连接酶来产生挂锁环形DNA模板，以及用于滚环扩增的Phi29DNA聚合酶。这些酶是昂贵的。而且，这些酶不适用于自动化系统和方法。由于这些原因，邻近连接测定法通常不被认为可用于商业应用。
技术实现思路
申请人开发了一种检测位于样品近侧的靶标的优良方法。在本申请的一个方面，提供了一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)形成第二靶标-暴露酶-抗体缀合物复合物；(b)形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)使第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的经掩蔽的半抗原暴露，以形成第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物；(d)使样品与第一检测试剂接触，以标记第一靶标-暴露的半抗原-抗体偶联物复合物或第一靶标；和(e)检测经标记的第一靶标-暴露的半抗原-抗体偶联物复合物或经标记的第一靶标。在一些实施方案中，所述第一检测试剂包含(i)对第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物的暴露半抗原具有特异性的二级抗体，二级抗体缀合于第一酶，从而使得二级抗体用第一酶标记第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物；和(ii)第一酶的第一底物。在一些实施方案中，所述第一底物为生色底物或荧光底物。在一些实施方案中，所述第一检测试剂包含扩增组分，以使用多个第一报告蛋白部分标记第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物的暴露酶。在一些实施方案中，所述多个第一报告蛋白部分为半抗原。在一些实施方案中，所述第一检测试剂进一步包含对多个第一报告蛋白部分具有特异性的二级抗体，每个二级抗体缀合于第二报告蛋白部分。在一些实施方案中，所述第二报告蛋白部分选自扩增酶或荧光团。在一些实施方案中，所述第二报告蛋白部分为扩增酶并且其中所述第一检测试剂进一步包含扩增酶的第一生色底物或荧光底物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使样品与对第二靶标-暴露酶-抗体缀合物复合物的暴露酶具有特异性的第二底物接触和检测对应于第一底物与暴露酶之间反应的产物的信号。在本申请的另一方面，提供了一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)形成第二靶标-暴露酶-抗体缀合物复合物；(b)形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)暴露第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的经掩蔽的半抗原，以形成第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物；(d)进行信号扩增步骤，以使用多个报告蛋白部分标记第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物；和(e)检测多个报告蛋白部分。在一些实施方案中，所述多个报告蛋白部分为半抗原；并且其中所述方法进一步包括向多个第一报告蛋白部分引入二级抗体，每个二级抗体缀合于第二报告蛋白部分。在一些实施方案中，所述第二报告蛋白部分为扩增酶并且其中所述方法进一步包括引入扩增酶的生色底物或荧光底物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测样品中靶标的总量。在本申请的另一方面，提供了一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)形成第二靶标-暴露酶-抗体缀合物复合物；(b)形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)进行脱掩蔽步骤，从而使得第二靶标-暴露酶-抗体缀合物复合物的暴露酶与第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的酶底物部分反应，以形成第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物；(d)使样品与第一检测试剂接触，以标记第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物或第一靶标；和(e)检测经标记的第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标。在一些实施方案中，所述脱掩蔽步骤包括改变样品的温度。在一些实施方案中，所述脱掩蔽步骤包括更改样品的pH。在一些实施方案中，所述脱掩蔽步骤包括引入一个或多个洗涤步骤。在一些实施方案中，所述脱掩蔽步骤包括添加暴露酶的辅因子。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测样品中靶标的总量。在本申请的另一方面，提供了一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)使样品与对第一靶标具有特异性的经掩蔽的半抗原-抗体缀合物接触，以形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(b)使样品与对第二靶标具有特异性的暴露酶-抗体缀合物接触，以形成第二靶标-暴露酶-抗体缀合物复合物，其中选择暴露酶-抗体缀合物的暴露酶，从而使得其能够与经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的酶底物部分反应，以形成第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物；(c)使样品与第一检测试剂接触，以标记第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物或第一靶标；和(d)检测经标记的第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标。在一些实施方案中，经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的经掩本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)形成第二靶标‑暴露酶‑抗体缀合物复合物；(b)形成第一靶标‑经掩蔽的半抗原‑抗体缀合物复合物；(c)暴露第一靶标‑经掩蔽的半抗原‑抗体缀合物复合物的经掩蔽的半抗原，以形成第一靶标‑暴露半抗原‑抗体缀合物复合物；(d)使样品与第一检测试剂接触，以标记第一靶标‑暴露半抗原‑抗体缀合物复合物或第一靶标；和(e)检测经标记的第一靶标‑暴露半抗原‑抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.28 US 62/211,590;2016.02.29 US 62/301,4891.一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)形成第二靶标-暴露酶-抗体缀合物复合物；(b)形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)暴露第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的经掩蔽的半抗原，以形成第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物；(d)使样品与第一检测试剂接触，以标记第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物或第一靶标；和(e)检测经标记的第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标。2.权利要求1的方法，其中所述第一检测试剂包含(i)对第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物的暴露半抗原具有特异性的二级抗体，所述二级抗体缀合于第一酶，由此使得二级抗体用第一酶标记第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物；和(ii)第一酶的第一底物。3.权利要求2的方法，其中所述第一底物为生色底物或荧光底物。4.权利要求1的方法，其中所述第一检测试剂包含扩增组分，以使用多个第一报告蛋白部分标记第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物的暴露酶。5.权利要求4的方法，其中所述多个第一报告蛋白部分为半抗原。6.权利要求5的方法，其中所述第一检测试剂进一步包含对多个第一报告蛋白部分具有特异性的二级抗体，每个二级抗体缀合于第二报告蛋白部分。7.权利要求5的方法，其中所述第二报告蛋白部分选自扩增酶或荧光团。8.权利要求7的方法，其中所述第二报告蛋白部分为扩增酶并且其中所述第一检测试剂进一步包含扩增酶的第一生色底物或荧光底物。9.权利要求1的方法，进一步包括使样品与对第二靶标-暴露酶-抗体缀合物复合物的暴露酶具有特异性的第二底物接触和检测对应于第一底物与暴露酶之间反应的产物的信号。10.一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)形成第二靶标-暴露酶-抗体缀合物复合物；(b)形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)暴露第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的经掩蔽的半抗原，以形成第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物；(d)进行信号扩增步骤，以用多个报告蛋白部分标记第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物；和(e)检测多个报告蛋白部分。11.权利要求10的方法，其中所述多个报告蛋白部分为半抗原；并且其中所述方法进一步包括向多个第一报告蛋白部分引入二级抗体，每个二级抗体缀合于第二报告蛋白部分。12.权利要求11的方法，其中所述第二报告蛋白部分为扩增酶并且其中所述方法进一步包括引入扩增酶的生色底物或荧光底物。13.权利要求10的方法，进一步包括检测样品中靶标的总量。14.一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)形成第二靶标-暴露酶-抗体缀合物复合物；(b)形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)进行脱掩蔽步骤，从而使得第二靶标-暴露酶-抗体缀合物复合物的暴露酶与第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的酶底物部分反应，以形成第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物；(d)使样品与第一检测试剂接触，以标记第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物或第一靶标；和(e)检测经标记的第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标。15.权利要求14的方法，其中所述脱掩蔽步骤包括改变样品的温度。16.权利要求14的方法，其中所述脱掩蔽步骤包括更改样品的pH。17.权利要求14的方法，其中所述脱掩蔽步骤包括引入一个或多个洗涤步骤。18.权利要求14的方法，其中所述脱掩蔽步骤包括添加暴露酶的辅因子。19.权利要求14的方法，进一步包括检测样品中靶标的总量。20.一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)使样品与对第一靶标具有特异性的经掩蔽的半抗原-抗体缀合物接触，以形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(b)使样品与对第二靶标具有特异性的暴露酶-抗体缀合物接触，以形成第二靶标-暴露酶-抗体缀合物复合物，其中选择暴露酶-抗体缀合物的暴露酶，从而使得其能够与经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的酶底物部分反应，以形成第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物；(c)使样品与第一检测试剂接触，以标记第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物或第一靶标；和(d)检测经标记的第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标。21.权利要求20的方法，其中经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的经掩蔽的半抗原衍生自选自以下的半抗原：DCC、生物素、硝基吡唑、噻唑磺酰胺、苯并呋咱和2-羟基喹喔啉。22.权利要求20的方法，其中所述暴露酶-抗体缀合物的暴露酶选自碱性磷酸酶、B-葡萄糖苷酶、B-半乳糖苷酶、B-葡糖醛酸糖苷酶、脂肪酶、硫酸酯酶、酰胺酶、蛋白酶、硝基还原酶、β-内酰胺酶、神经氨酸酶和尿素酶。23.权利要求20的方法，其中所述第一检测试剂包含(i)对第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物的暴露半抗原具有特异性的二级抗体，所述二级抗体缀合于第一酶，从而使得二级抗体使用第一酶标记第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物；和(ii)第一生色底物或荧光底物。24.权利要求23的方法，其中所述第一酶不同于暴露酶。25.权利要求24的方法，其中所述第一酶为过氧化物酶。26.权利要求23的方法，其中所述第一生色底物选自3,3’-二氨基联苯胺(DAB)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、HRP-银和酪胺-色原。27.权利要求26的方法，进一步包括使样品与对第二靶标-暴露酶-抗体缀合物复合物的暴露酶具有特异性的第一生色底物或荧光底物接触，其中所述第一和第二生色底物不同。28.权利要求20的方法，其中所述第一检测试剂包含扩增引入第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物的标记的量的组分。29.权利要求20的方法，其中所述第一靶标为PD-1或PD-L1中的一个，并且所述第二靶标为PD-1或PD-L1中的另一个。30.一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)使样品与第一检测探针接触，所述第一检测探针包含经掩蔽的半抗原-抗体缀合物或暴露酶-抗体缀合物中的一个；(b)使样品与第二检测探针接触，所述第二检测探针包含经掩蔽的半抗原-抗体缀合物或暴露酶-抗体缀合物中的另一个；(c)使样品至少与第一检测试剂接触，以标记形成的暴露半抗体-抗体缀合物靶标复合物；和(d)检测来自经标记的暴露半抗原-抗体缀合物靶标复合物的信号。31.权利要求30的方法，进一步包括检测样品中靶标的总量的步骤。32.权利要求30的方法，其中所述第一检测试剂包含扩增组分，以使用多个第一报告蛋白部分标记第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物的暴露酶。33.权利要求32的方法，其中所述多个第一报告蛋白部分为半抗原。34.权利要求33的方法，其中所述第一检测试剂进一步包含对多个第一报告蛋白部分具有特异性的二级抗体，每个二级抗体缀合于第二报告蛋白部分。35.权利要求34的方法，其中所述第二报告蛋白部分选自扩增酶或荧光团。36.权利要求34的方法，其中所述第二报告蛋白部分为扩增酶并且其中所述第一检测试剂进一步包含扩增酶的第一生色底物或荧光底物。37.权利要求30的方法，其中所述方法进一步包括脱掩蔽步骤。38.一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)使样品与对第一靶标具有特异性的经掩蔽的半抗原-抗体缀合物接触，以形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(b)使样品与对第二靶标具有特异性的暴露酶-抗体缀合物接触，以形成第二靶标-暴露酶-抗体缀合物复合物，其中选择暴露酶-抗体缀合物的暴露酶，从而使得其能够与经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的酶底物部分反应，以形成第一靶标-暴露半抗原-抗体缀合物复合物；(c)使样品与特异性结合于第一靶标-暴露半抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y·贝勒斯拉德塞维，T·D·德格，W·J·弗兰池，J·郝，B·D·凯丽，A·穆律罗，N·W·波拉斯克，
申请(专利权)人：文塔纳医疗系统公司，
类型：发明
国别省市：美国,US