一种检测黄曲霉毒素B1的时间分辨荧光试纸条及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测黄曲霉毒素B1的时间分辨荧光试纸条及其应用。试纸条包括样品吸收垫、反应膜以及吸水垫，反应膜位于中间，样品吸收垫与吸水垫分别搭接于反应膜左右两端；样品吸收垫上设有加样区和微球区，微球区上载有黄曲霉毒素B1时间时间分辨荧光微球；反应膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)，T线接上包被黄曲霉毒素B1抗原(包被原)，C线包被抗兔抗体。本发明专利技术还提供了一种应用上述黄曲霉毒素B1试纸条检测谷物粮食、食用油、花生、玉米类饲料(预混料)等样品中黄曲霉毒素B1残留的方法。本发明专利技术所提供的试纸条具有操作简单、灵敏度高、定量检测、快速检测、成本低等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。

A time resolved fluorescent test paper for the detection of aflatoxin B1 and its application

The present invention discloses a time resolved fluorescent test paper for the detection of aflatoxin B1 and its application. The strip includes sample absorption pad, reaction film and absorbent pad, reaction film in the middle of sample absorption pad and absorbent pad are respectively overlapped on the reaction film pad is arranged on the left and right ends; sample region and district microsphere absorbing sample microspheres carrying area of aflatoxin B1 time resolved fluorescent microspheres; the reaction film has a detection line (T line) and the control line (C line), T line was coated on aflatoxin B1 antigen (coatingen), C wire coated anti rabbit antibody. The invention also provides a method for detecting aflatoxin B1 residues in grain, grain, edible oil, peanut and corn feed (premix) and other samples by applying aflatoxin B1 test strip. The test strip provided by the invention has the characteristics of simple operation, high sensitivity, quantitative detection, rapid detection and low cost, and is suitable for large sample screening and on-site monitoring.

【技术实现步骤摘要】
一种检测黄曲霉毒素B1的时间分辨荧光试纸条及其应用
本专利技术涉及一种检测黄曲霉毒素B1的时间分辨荧光试纸条及其应用，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)
，用于谷物粮食、食用油、花生、玉米类饲料(预混料)等样品中黄曲霉毒素B1的含量检测。
技术介绍
黄曲霉毒素B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，是已知化学物质中致癌性最强的一种。黄曲霉毒素B1对人和动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝脏的损害。黄曲霉毒素B1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品，且以南方高温、高湿地区受污染最为严重。黄曲霉毒素耐热，280℃才可裂解，故一般烹调加工温度下难以破坏。黄曲霉毒素B1的毒性要比呕吐毒素的毒性强30倍，比玉米赤霉烯酮的毒性强20倍。黄曲霉毒素B1的急性毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，慢性毒性可诱发癌变，致癌能力为二甲基亚硝胺的75倍，人的原发性肝癌也很可能与黄曲霉毒素有关。因此，我国相关质检部门对该物质进行了限量规定。目前，检测黄曲霉毒素B1的方法有薄层色谱法、液相色谱法、酶联免疫法、液相色谱串联质谱法等。仪器检测方法的精确度较高，但是仪器昂贵，需要专业的技术人员，检测步骤复杂，难以批量检测样品，不适用于基层实验室批量、快速检测样品。而免疫学检测方法操作简单、快速、灵敏，可同时检测多数样品，是理想的快速筛选手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的黄曲霉毒素B1时间分辨荧光试纸条。本专利技术所提供了一种黄曲霉毒素B1时间分辨荧光试纸条，该试纸条包括样品吸收垫、反应膜以及吸水垫三部分。反应膜位于中间，样品吸收垫与吸水垫分别搭接于反应膜左右两端。其中，样品吸收垫上设有加样区和微球区，微球区上载有时间分辨荧光微球；反应膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)，T线接上包被黄曲霉毒素B1抗原，C线包被抗兔抗体。所述黄曲霉毒素B1时间分辨荧光微球，包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有黄曲霉毒素B1单克隆抗体的荧光微球，质控微球为表面包被有兔抗标记蛋白的荧光微球。所述荧光微球中填充了斓系元素化合物；较优的，该斓系元索鳌合物为铕鳌合物；最优的，该铕鳌合物可为Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen。所述蛋白可以是牛血清Y-球蛋白(BGG)或小牛血清白蛋白(BSA)。所述时间分辨荧光微球粒径范围为100-1000nm。所述硝酸纤维素膜上，T线上包被的抗体为黄曲霉毒素B1抗原，C线上包被的抗兔抗体。所述黄曲霉毒素B1时间分辨荧光免疫定量检测试纸条底部设有塑料底板。所述T线接上包被黄曲霉毒素B1抗原是由黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。所述黄曲霉毒素B1单克隆抗体是以黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，是由黄曲霉毒素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述抗兔抗体是将兔源抗体免疫羊得到。所述样品吸收垫为Fusion5膜或其他功能相同的膜；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水垫；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。本专利技术的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：(1)质控微球制备：①用生物素标记蛋白；②采用上述标记蛋白包被醛基修饰的荧光微球；(2)半抗原制备：将黄曲霉毒素B1与4-肼基苯甲酸反应得到黄曲霉毒素B1半抗原产物；(3)将黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白偶联，得到黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物；(4)用黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物免疫新西兰大白兔，将新西兰大白兔脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到黄曲霉毒素B1单克隆杂交瘤细胞株；(5)提取新西兰大白兔IgG免疫健康山羊，得到抗兔抗体；(6)检测微球制备：采用黄曲霉毒素B1的单克隆抗体包被醛基修饰的荧光微球；(7)空白大卡粘贴：将硝酸纤维素膜粘贴在塑料底板中间，Fusion5膜与吸水垫分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端；(8)喷膜：将兔抗标记蛋白的荧光微球和黄曲霉毒素B1单克隆抗体的荧光微球采用释放缓冲液混合稀释到一定浓度，喷到Fusion5膜的微球区；黄曲霉毒素B1抗原和抗兔抗体稀释后，分别喷到硝酸纤维素膜的T线和C线位置；(9)干燥及切条：将上述喷好试剂的大卡烘干、切条。喷膜步骤中用到的释放缓冲液含有10％-20％蔗糖、3％-10％海藻糖、0.5％-1％N，0-双三甲硅基乙酰胺(BSA)，0.2％-0.5％庆大霉素。喷膜步骤稀释后检测微球终浓度为0.5mg/mL-2mg/mL，质控微球终浓度0.05mg/mL-0.2mg/mL；T线抗原终浓度0.5mg/mL-2mg/mL，C线抗原终浓度0.5mg/mL-2mg/mL；C，T线喷膜液量为0.5μL/cm-1.5μL/cm，微球喷膜量为2μL/cm-8μL/cm。干燥及切条步骤中所述的烘干可在恒温烘箱或者烘房中，37℃烘干8-12小时。本专利技术的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测谷物粮食、食用油、花生、玉米类饲料(预混料)等样品中黄曲霉毒素B1残留的方法，它包括步骤：(1)样品前处理；(2)用试纸条进行检测；(3)分析检测结果。本专利技术的黄曲霉毒素B1时间分辨荧光试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将黄曲霉毒素B1单克隆抗体-时间分辨荧光标记物固定于Fusion5膜上，样品中的黄曲霉毒素B1在流动过程中，与Fusion5膜上的黄曲霉毒素B1单克隆抗体-时间分辨荧光标记物结合，形成药物-抗体-时间分辨荧光标记物。样品中的药物与反应膜检测线上的黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合黄曲霉毒素B1单克隆抗体-时间分辨荧光标记物，最终应用免疫层析检测仪计算待测样品液中含有的黄曲霉毒素B1残留量。本专利技术的试纸条具有特异性强、灵敏度高、定量检测、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本专利技术试纸条检测黄曲霉毒素B1残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。附图说明图1为黄曲霉毒素B1半抗原合成路线图。图2为黄曲霉毒素B1半抗原核磁共振氢谱图。图3为黄曲霉毒素B1包被原/免疫原合成路线图。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。实施例1黄曲霉毒素B1检测试纸条的制备该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：1)制备喷涂有黄曲霉毒素B1单克隆抗体-时间分辨荧光标记物的样品吸收垫；2)制备具有包被有黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有抗兔抗体的质控线的反应膜；3)将1)和2)制备好的样品吸收垫、反应膜以及吸水垫组装成试纸条。下面分步详细叙述：1、黄曲霉毒素B1半抗原的制备将31.2mg黄曲霉毒素B1溶于2ml乙醇中，加入12mg氰基硼氢化钠，0℃搅拌溶解。加入16.5mg4-肼基苯甲酸，搅拌，缓慢升温至50℃，搅拌1h。蒸干溶剂，柱层析纯化，得39mg白色固体，收率88％。3.9的黄曲霉毒素B1的甲基峰以及12.7的4-肼基苯甲酸的羧基峰存在，说明半抗原合成成功。该方法制备的半抗原是用4-肼基苯甲酸，通过一步反应引入羧基，并且连接臂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测黄曲霉毒素B1的时间分辨荧光试纸条，包括样品吸收垫、反应膜以及吸水垫，其特征在于所述反应膜位于中间，样品吸收垫与吸水垫分别搭接于反应膜左右两端；所述样品吸收垫上设有加样区和微球区，微球区上载有黄曲霉毒素B1时间时间分辨荧光微球；所述反应膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)，T线接上包被黄曲霉毒素B1抗原(包被原)，C线包被抗兔抗体，所述黄曲霉毒素B1抗原是黄曲霉毒素B1半抗原‑载体蛋白偶联物，所述黄曲霉毒素B1半抗原的制备方法如下：将31.2mg黄曲霉毒素B1溶于2ml乙醇中，加入12mg氰基硼氢化钠，0℃搅拌溶解。加入16.5mg 4‑肼基苯甲酸，搅拌，缓慢升温至50℃，搅拌1h。蒸干溶剂，柱层析纯化，得39mg白色固体，收率88％。

【技术特征摘要】
1.一种检测黄曲霉毒素B1的时间分辨荧光试纸条，包括样品吸收垫、反应膜以及吸水垫，其特征在于所述反应膜位于中间，样品吸收垫与吸水垫分别搭接于反应膜左右两端；所述样品吸收垫上设有加样区和微球区，微球区上载有黄曲霉毒素B1时间时间分辨荧光微球；所述反应膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)，T线接上包被黄曲霉毒素B1抗原(包被原)，C线包被抗兔抗体，所述黄曲霉毒素B1抗原是黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物，所述黄曲霉毒素B1半抗原的制备方法如下：将31.2mg黄曲霉毒素B1溶于2ml乙醇中，加入12mg氰基硼氢化钠，0℃搅拌溶解。加入16.5mg4-肼基苯甲酸，搅拌，缓慢升温至50℃，搅拌1h。蒸干溶剂，柱层析纯化，得39mg白色固体，收率88％。2.如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的时间分辨荧光试纸条，其特征在于所述黄曲霉毒素B1半抗原是由黄曲霉毒素B1与4-肼基苯甲酸反应得到，其分子结构式为：3.如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的时间分辨荧光试纸条，其特征在于所述黄曲霉毒素B1时间分辨荧光微球，包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有黄曲霉毒素B1单克隆抗体的荧光微球，质控微球为表面包被有兔抗标记蛋白的荧光微球。4.如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的时间分辨荧光试纸条，黄曲霉毒素B1单克隆抗体是以黄曲霉毒素B1半抗原...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚承志，
申请(专利权)人：联合益康北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11