The present invention relates to the field of tumor cells, in particular, a method for detecting circulating tumor cells in the blood. A kind of circulating tumor cells in the blood detection method, which is characterized in that the implementation followed by the following steps: A. B. blood treatment; cell enrichment; C. D. closed and fixed cells; antibody incubation; e. scanning. The invention has no separation, full enrichment and high precision.
【技术实现步骤摘要】
血液中循环肿瘤细胞的检测方法
本专利技术涉及肿瘤细胞领域,具体为一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法。
技术介绍
原发肿瘤生长到一定阶段会侵扰周围血管,首先通过整联蛋白附着于血管基底膜处生长,随着肿瘤细胞逐渐增多,其分泌的基底金属蛋白酶也逐渐增加,通过逐步消化掉IV型胶原蛋白,突破基底膜屏障进入血液,即被称为循环肿瘤细胞(即CTC),CTC进入血液后会随着血液循环游走全身,形成复发转移。CTC是一种新型肿瘤标志物,通过检测CTC数量可对肿瘤进行确诊、判断预后和监控疗效,通过对比手术和放化疗前后血液中的CTC数量,可以判断治疗是否有效。目前CTC富集的方法主要有两类。第一类是基于抗体分离CTCs(CTCs是CTC的复数形式)。最常见的是正性分离,即用抗体与CTCs表面受体结合来分离。这类技术通常以EpCAM抗体标记的磁珠与表达EpCAM的CTCs结合来分离CTCs。正性分离的缺陷在于:很多肿瘤细胞不表达或弱表达EpCAM。如:超过一半的ALK基因融合阳性的肺癌CTCs弱表达甚至完全不表达EpCAM,从而导致检测结果假阴性。另一种是负性分离,利用CD45抗体标记的磁珠去除白细胞后,收集剩余细胞做CTCs检测。负性分离的效率在50~80%间大幅波动。主要原因在于CTCs会吞噬磁珠,亦或因CTCs与白细胞粘连而被去除,导致分离效率不稳定,甚至在同一病人一个时间点收集的两份血样中,检测到的CTCs数目能出现数量级差异。而最近俄亥俄州立大学肿瘤中心确认了在患者体内,有些癌细胞同时表达CD45和CK。因此利用负性分离也有严重假阴性结果。总之,利用抗体分离CTCs亟需解决假阴 ...
【技术保护点】
一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法,其特征是:按如下步骤依次实施:a. 全血处理:向2mL全血中加入200μL的红细胞裂解液,室温放置15min,放置期间均匀摇晃;200RCF下离心5min,吸除上清液,保留细胞;向离心管中加入2mL、质量百分比浓度为1%的FPBS溶液,FPBS即血纤蛋白原结合蛋白,混匀后于200RCF下离心5min,去除上清液;FPBS溶液的体积配比为:FBS:PBS=1:99,FBS全称fetal bovine serum,即胎牛血清,PBS全称Phosphate Buffered Saline,即磷酸盐缓冲液;b. 细胞全富集:加入1mL的FPBS溶液,混合均匀后转入用APTES处理的培养皿中,APTES即3‑氨丙基三乙氧基硅烷,分子式H2NCH2CH2CH2Si(OC2H5)3,将培养皿置于37℃摇床中培养45min;培养后将培养皿置于4℃环境中静置10min;c. 细胞固定:吸除FPBS,向培养皿中加入质量百分比浓度为4%甲醛溶液后置于4℃环境中静置10min;吸除甲醛,加入1mL甲醇,置于‑20℃环境中静置10min;吸除甲醇,用2mL的PBS清洗三次;d. ...
【技术特征摘要】
1.一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法,其特征是:按如下步骤依次实施:a.全血处理:向2mL全血中加入200μL的红细胞裂解液,室温放置15min,放置期间均匀摇晃;200RCF下离心5min,吸除上清液,保留细胞;向离心管中加入2mL、质量百分比浓度为1%的FPBS溶液,FPBS即血纤蛋白原结合蛋白,混匀后于200RCF下离心5min,去除上清液;FPBS溶液的体积配比为:FBS:PBS=1:99,FBS全称fetalbovineserum,即胎牛血清,PBS全称PhosphateBufferedSaline,即磷酸盐缓冲液;b.细胞全富集:加入1mL的FPBS溶液,混合均匀后转入用APTES处理的培养皿中,APTES即3-氨丙基三乙氧基硅烷,分子式H2NCH2CH2CH2Si(OC2H5)3,将培养皿置于37℃摇床中培养45min;培养后将培养皿置于4℃环境中静置10min;c.细胞固定:吸除FPBS,向培养皿中加入质量百分比浓度为4%甲醛溶液后置于4℃环境中静置10min;吸除甲醛,加入1mL甲醇,置于-20℃环境中静置10min;吸除甲醇,用2mL的PBS清洗三次;d.封闭及抗体孵育:向培养皿中加入1mL用PBS配制的封闭液,在4℃环境下避光孵育1hour;封闭液的配制方法是:首先用PBS配置浓度为5%(m/V)的脱脂奶粉,然后向脱脂奶粉中加入Tween-20使Tween-20的浓度为0.02%(V/V),即为封闭液,m/V指溶质质量/溶液体积,V/V指溶质体积/溶液体积;吸除脱脂奶粉后,沿培养皿的侧壁加入2mL的PBST(即含0.02...
【专利技术属性】
技术研发人员:张群,祝琳,阚奇,
申请(专利权)人:上海浦美生物医药科技有限公司,
类型:发明
国别省市:上海,31
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