用于乏氧诱导因子的时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种用于乏氧诱导因子的时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒，该技术方案首先基于实验手段确定了H1α67、1A3两株具有良好免疫活性的抗乏氧诱导因子单克隆抗体。在此基础上，以TRFIA法测得荧光值和检测本底为依据确定将H1α67株作为包被抗体、将1A3株作为标记抗体，能获得更加灵敏的检测效果。与此同时，本发明专利技术对包被条件、镧系元素标记方法以及检测条件等进行了针对性设计，同时围绕上述抗体及待测抗原的生物学特性给出了适宜的缓冲液、洗涤液、增强液成分，有效保证了检测的灵敏性和结果的稳定性。而且可依托于检测设备实现高度的自动化，为临床中乏氧指标的精确检测提供了一种切实可行的方法。

Time resolved fluoro immunoassay method and kit for hypoxia inducible factor

The invention provides a time-resolved fluoro immunoassay method and kit for hypoxia inducible factor. Based on experimental means, the H1 monoclonal antibody 67 and 1A3 two have monoclonal antibodies against hypoxia inducible factor. On this basis, based on the fluorescence value and the background detected by TRFIA, it is concluded that the H1 alpha 67 strain as the coating antibody and the 1A3 strain as the marker antibody can get a more sensitive detection effect. At the same time, the invention of coating conditions, lanthanide labeling and detection conditions were designed. At the same time on the biological characteristics of antibody and antigen to be detected is given the appropriate buffer solution, washing liquid, enhancing liquid composition, effectively guarantee the stability of detection sensitivity and results. It can also provide a practical method for the accurate detection of hypoxia index in clinical.

【技术实现步骤摘要】
用于乏氧诱导因子的时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒
本专利技术涉及时间分辨荧光免疫分析
，进一步涉及乏氧水平的检测技术，具体涉及一种用于乏氧诱导因子的时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒。
技术介绍
肿瘤的放射治疗仍然是目前临床上应用最广泛和最重要的治疗手段之一，然而各种肿瘤甚至同种肿瘤不同病理类型、不同病人其治疗效果却很大差异，其中一个重要原因就是肿瘤细胞对射线作用的敏感性不同，但是目前所采用的各种肿瘤的常规放疗方案，大都基于把某一类型的肿瘤患者看作是放疗反应相同的个体，而同一类型间存在的固有放射敏感性的差异，显著地影响了肿瘤的放疗疗效。此问题在结直肠癌中更加突出，由于结直肠在腹腔的解剖位置限制，获得较宽的阴性切缘较困难,因此局部复发率高，一个Meta分析表明术前放疗的有效剂量可减少57％的局部复发。但是，术前放疗提高了肿瘤患者的局部控制和生存率同时也增加了术后并发症和死亡率，放疗前必需有较精确的分期选择病人，确立放疗敏感病人的选择标准是关键。放疗利用电离辐射引起的自由基爆发杀死癌细胞，这一过程与肿瘤部位的氧分压密切相关，与大多数实体瘤一样，结直肠癌细胞存在不同程度的乏氧区，也是放疗抵抗的根本原因之一。因此，乏氧程度与放疗敏感性呈现高度负相关，乏氧微环境是目前肿瘤治疗的研究热点。HIF-1α是细胞缺氧时产生，精确调节细胞代谢中的氧含量，为放疗下存在的肿瘤细胞提供能量，从而诱导肿瘤组织产生放疗抵抗性。对比实验表明，HIF-1α表达水平与体内氧分压水平密切相关，与肿瘤预后有高度的相关性，因此，HIF-1α是目前放疗敏感性评价特异性最好的分子靶标之一。然而，HIF-1α在体外检测时受到环境氧分压影响，β亚基通过泛素化被迅速降解，含量很低。目前血清乏氧诱导因子的检测主要有酶联免疫法(ELISA)，由于收到示踪剂形状的限制，ELISA的灵敏度不高(灵敏度＜10-15)，范围有限，不能够满足临床检测的要求，需要灵敏度更高的超微量检测技术。时间分辨荧光免疫分析(time-resolvedfluoroimmunoassay，简称TRFIA)是上世纪80年代初发展起来的一项非放射性超微量免疫分析技术，它的独特技术有别于传统的荧光免疫标记技术的特点和优势。与现代应用的放射免疫分析(RIA)，酶免分析(EIA)，新兴的化学发光免疫分析(CLIA)及电化学发光免疫分析(ECLIA)相比，TRFIA具有灵敏度高，操作简单，螯合试剂稳定，标准曲线范围宽，不受样品自然荧光干扰，无放射性污染，可进行多标记等优点，正逐渐成为替代传统的放免分析和酶免分析的新一代超微量测定技术。由于克服了酶标物不稳定、化学发光只能一次发光、易受环境干扰等缺点，TRFIA是目前免疫检测方法中灵敏度与特异性最好的微量分析方法，目前已应用于临床微量物质检测，如乙肝病毒标记、PSA、AFP等癌胚抗原的定量测定。然而当应用于具体物质的检测时，并不存在一种通用性的TRFIA检测方法，而需要根据待测物质的生物学特性进行针对性设计；其中，在实验框架层面就包括双抗夹心法、中和法以及小分子抗原竞争法等，而具体到某种抗原的检测时，还需要根据待测抗原的特性，从抗体选择、包被条件、镧系元素标记方法以及检测条件等角度进行设计，同时给出各反应物的适宜成分，以满足检测方法的准确性和稳定性。然而，由于检测效果优劣与方法条件之间并不存在明显的指向性关联，因此，依据现有技术的常规TRFIA方法难以得到一种适宜乏氧诱导因子检测的具体方法条件。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种用于乏氧诱导因子的时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒，以解决现有技术中缺乏一种适用于乏氧诱导因子的高效TRFIA检测方法的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术中针对乏氧诱导因子的常规检测方法灵敏度、特异性以及检测结果的稳定性均有待改善。本专利技术要解决的再一技术问题是现有技术中缺乏一种基于TRFIA分析方法高效检测乏氧诱导因子的具体试剂盒产品。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：用于乏氧诱导因子的时间分辨荧光免疫分析方法，包括以下步骤：1)取克隆号为H1α67的抗乏氧诱导因子单克隆抗体，用第一缓冲液稀释其浓度至1～10mg/L，作为包被液，包被反应板，而后加入封闭液封闭，再抽干封闭液；其中，所述第一缓冲液是浓度为50mmol/L、pH为9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；所述封闭液是含有3g/L牛血清白蛋白的第一缓冲液；2)取与步骤1)所述抗乏氧诱导因子单克隆抗体具有不同抗原表位的另一种抗乏氧诱导因子单克隆抗体，利用镧系元素离子标记，得到标记抗体；3)将步骤2)所得的标记抗体用反应缓冲液以1:(25～100)的体积比稀释，得到稀释的标记抗体，将所述稀释的标记抗体与待测样品以(5～10):1的体积比共同加入至步骤1)所得反应板的同一孔中，混合后于25℃孵育2h；其中所述反应缓冲液是含有8mmol/LNaCl、0.1％BSA、50μmol/LDTPA、0.1ml/LTween-80、0.1％NaN3的，浓度为50mmol/L的Tris-HCl缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.8；4)洗涤液洗涤反应板，而后加入与洗涤前孔中液体等体积的增强液，于25℃振荡反应5min，进行荧光检测；其中所述洗涤液是含有0.2ml/LTween-80、0.2％NaN3、14.5mmol/LNaCl的水溶液；所述增强液是含有15μmol/Lβ-萘甲酰三氟丙酮、50μmol/L三正辛基氧化磷，同时含有Triton200、醋酸和邻苯二甲酸氢钾的水溶液；所述增强液的pH值为2.0～3.2。作为优选，步骤1)包被液中克隆号为H1α67的抗乏氧诱导因子单克隆抗体的浓度为5mg/L。作为优选，步骤3)中稀释的体积比为1:50。作为优选，步骤3)中稀释的标记抗体与待测样品之间体积比为3:1。作为优选，步骤2)所述镧系元素离子选自Eu3+或Sm3+之一。作为优选，步骤2)具体包括以下操作：将镧系元素离子的水溶液与所述另一种抗乏氧诱导因子单克隆抗体共孵育，螯合反应产物经柱层析分离，即得到所述标记抗体；其中所述镧系元素离子的水溶液中镧系元素离子的质量为所述另一种乏氧诱导因子单克隆抗体质量的1/5～1。作为优选，步骤2)中所述另一种抗乏氧诱导因子单克隆抗体是克隆号为1A3的抗乏氧诱导因子单克隆抗体。作为优选，所述单克隆抗体均为鼠抗人单克隆抗体。作为优选，所述反应板是48孔板或96孔板。作为优选，以上步骤3)和步骤4)是在时间分辨荧光免疫分析仪器上完成的。同时，本专利技术还提供了一种基于上述分析方法的检测试剂盒，包括反应缓冲液，洗涤液，增强液，包被有克隆号为H1α67的抗乏氧诱导因子单克隆抗体的反应板，由铕离子或钐离子标记的克隆号为1A3的抗乏氧诱导因子单克隆抗体，乏氧诱导因子重组蛋白标准品及质控品；其中所述反应缓冲液是含有8mmol/LNaCl、0.1％BSA、50μmol/LDTPA、0.1ml/LTween-80、0.1％NaN3的，浓度为50mmol/L的Tris-HCl缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.8；所述洗涤液是含有0.2ml/LTween-80、0.2％NaN3、14.5mmol/LNaCl本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于乏氧诱导因子的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于包括以下步骤：1)取克隆号为H1α67的抗乏氧诱导因子单克隆抗体，用第一缓冲液稀释其浓度至1～10mg/L，作为包被液，包被反应板，而后加入封闭液封闭，再抽干封闭液；其中，所述第一缓冲液是浓度为50mmol/L、pH为9.6的碳酸钠‑碳酸氢钠缓冲液；所述封闭液是含有3g/L牛血清白蛋白的第一缓冲液；2)取与步骤1)所述抗乏氧诱导因子单克隆抗体具有不同抗原表位的另一种抗乏氧诱导因子单克隆抗体，利用镧系元素离子标记，得到标记抗体；3)将步骤2)所得的标记抗体用反应缓冲液以1:(25～100)的体积比稀释，得到稀释的标记抗体，将所述稀释的标记抗体与待测样品以(5～10):1的体积比共同加入至步骤1)所得反应板的同一孔中，混合后于25℃孵育2h；其中所述反应缓冲液是含有8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/L DTPA、0.1ml/L Tween‑80、0.1％NaN3的，浓度为50mmol/L的Tris‑HCl缓冲液；所述Tris‑HCl缓冲液的pH值为7.8；4)洗涤液洗涤反应板，而后加入与洗涤前孔中液体等体积的增强液，于25℃振荡反应5min，进行荧光检测；其中所述洗涤液是含有0.2ml/L Tween‑80、0.2％NaN3、14.5mmol/L NaCl的水溶液；所述增强液是含有15μmol/Lβ‑萘甲酰三氟丙酮、50μmol/L三正辛基氧化磷，同时含有Triton 200、醋酸和邻苯二甲酸氢钾的水溶液；所述增强液的pH值为2.0～3.2。...

【技术特征摘要】
1.用于乏氧诱导因子的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于包括以下步骤：1)取克隆号为H1α67的抗乏氧诱导因子单克隆抗体，用第一缓冲液稀释其浓度至1～10mg/L，作为包被液，包被反应板，而后加入封闭液封闭，再抽干封闭液；其中，所述第一缓冲液是浓度为50mmol/L、pH为9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；所述封闭液是含有3g/L牛血清白蛋白的第一缓冲液；2)取与步骤1)所述抗乏氧诱导因子单克隆抗体具有不同抗原表位的另一种抗乏氧诱导因子单克隆抗体，利用镧系元素离子标记，得到标记抗体；3)将步骤2)所得的标记抗体用反应缓冲液以1:(25～100)的体积比稀释，得到稀释的标记抗体，将所述稀释的标记抗体与待测样品以(5～10):1的体积比共同加入至步骤1)所得反应板的同一孔中，混合后于25℃孵育2h；其中所述反应缓冲液是含有8mmol/LNaCl、0.1％BSA、50μmol/LDTPA、0.1ml/LTween-80、0.1％NaN3的，浓度为50mmol/L的Tris-HCl缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.8；4)洗涤液洗涤反应板，而后加入与洗涤前孔中液体等体积的增强液，于25℃振荡反应5min，进行荧光检测；其中所述洗涤液是含有0.2ml/LTween-80、0.2％NaN3、14.5mmol/LNaCl的水溶液；所述增强液是含有15μmol/Lβ-萘甲酰三氟丙酮、50μmol/L三正辛基氧化磷，同时含有Triton200、醋酸和邻苯二甲酸氢钾的水溶液；所述增强液的pH值为2.0～3.2。2.根据权利要求1所述的用于乏氧诱导因子的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于步骤1)包被液中克隆号为H1α67的抗乏氧诱导因子单克隆抗体的浓度为5mg/L。3.根据权利要求1所述的用于乏氧诱导因子的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于步骤3)中稀释的体积比为1:50。4.根据权利要求1所述的用于乏氧诱导因子的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于步骤3)中稀释的标记抗体与待测样品之间体积比为3:1。5.根据权利要求1所述的用于乏氧诱导因子的时...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晓靓，王浩，杨福军，宋娜玲，
申请(专利权)人：中国医学科学院放射医学研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12