抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒制造技术

本发明专利技术属于医学及生物化学技术领域，具体是一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒。该试剂盒由试剂R1和试剂R2组成，试剂R1包括：生物缓冲剂、促凝剂、表面活性剂、渗透压调节剂和水；试剂R2包括：包被抗环瓜氨酸肽抗原的乳胶颗粒、生物缓冲剂、封闭剂、防腐剂和水。该抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒采用胶乳增强免疫比浊法来进行测定，相对于传统的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒，具有快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好等优点。

【技术实现步骤摘要】
抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒
本专利技术涉及医学及生物化学
，具体是一种测定抗环瓜氨酸肽抗体的试剂盒。
技术介绍
类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种常见的以累及周围关节为主的多系统性炎症性的自身免疫病，发病两年内即可出现不可逆的骨关节破坏，并可引起多种并发症，如神经系统疾病、心包炎、淋巴腺炎等。早期明确诊断及判断病情发展趋势有助于临床医生应用改善病程药控制疾病，有效地减少关节侵蚀的发生。目前RA的诊断仍主要以临床表现、X线及类风湿因子(rheumatoidfactor，RF)等1987年美国风湿病协会修订的分类诊断为依据，符合此标准的患者常已有关节破坏，加上RF缺乏特异性，不利于RA的早期诊断。近年来陆续发现的抗角蛋白抗体(AKA)、抗核周因子(APF)、抗Sa抗体、抗纤聚蛋白抗体(AFA)都对RA有较高的特异性，并可在疾病的早期出现。进一步研究表明，其抗原位点是环胱氨酸多肽(cycliccitrullinatedpeptide，CCP)，该肽段是在肽基精氨酸脱亚胺酶的催化下，由蛋白质中的精氨酸转化而成。2000年Schellekens等首次人工合成由21个氨基酸残基组成的环瓜氨酸肽，建立酶联免疫吸附试验方法(ELISA)检测RA患者血清中的抗CCP抗体，发现该抗体在RA诊断中具有很高的敏感型和特异性。抗环瓜氨酸多肽抗体的检测较APF和AKA检测具有一定的优越性，因此抗环瓜氨酸多肽抗体的检测对RA的诊断具有重要意义。目前，国外的抗CCP抗体对RA的检测已普遍用于临床，国内自2001年以来也逐步应用于临床。文献显示，抗CCP抗体的特异性多在94％以上，敏感性为41％～87％。可见抗CCP抗体检测对RA的诊断具有较高的特异度，与目前通用的RA分类标准中唯一的血清学诊断指标RF(敏感性高但特异性差)相比，具有明显的优势。而且对供血员的连续检测表明，抗CCP抗体的检出可以比临床症状的出现提前数年，可见这一新的血清学诊断指标对RA的早期诊断具有重要的意义，值得推广，以早期治疗患者，降低致残率。目前国内外市场上的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒主要应用酶联免疫吸附法(ELISA法)，它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比，可定性或定量检测患者血清中抗CCP抗体。其特异性来自抗体或抗原的选择性，抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间，由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。ELISA法检测具有特异性高、价格低廉的优点，但是一般采用手工操作，操作繁琐效率低，且人为影响因素大，结果只能定性或不精确地定量。因此，在这高效率的自动化时代，特异性高、操作简便的全自动化检测方法必将有良好的市场前景。目前国内已有体外诊断试剂公司开发出采用“胶乳增强免疫比浊法”检测的抗环瓜氨酸肽抗体试剂盒，并已投入临床应用。胶乳增强比浊法是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。胶乳增强比浊法通过在高分子乳胶微球表面交联的单克隆抗体，而当抗原与交联有抗体的微球结合后，能够在短时间内迅速聚集在一起，改变反应溶液的吸光度。而且，反应液吸光度的改变与被测抗原的浓度在一定范围内具有线性关系，可用来反映被测抗原的浓度。相对于ELISA法，胶乳增强免疫比浊法操作简单，抗干扰性更强，且可测线性范围也更宽，能利用普通的生化分析仪进行检测，容易实现自动化，可在各级基层医疗机构普及和应用。BizzaroN等检测了RA患者抗CCP抗体的水平，结果显示RA患者清血清中抗CCP抗体的平均水平为1100AU/ml(范围为：57～3419AU/ml)，而对照组抗CCP抗体的平均水平仅为6.8AU/ml(范围为：1～39AU/ml)。如此宽广的浓度范围，对检测试剂盒灵敏度和线性范围均提出了较高的要求。目前市场上已有胶乳增强免疫透射比浊法测定抗CCP抗体浓度的试剂盒，但这些试剂盒无法同时满足宽线性范围和高灵敏度的要求，因此需要稀释样本才能测定高浓度抗CCP抗体，这在使用上带来了不便。现有的乳胶增强免疫比浊法，如专利CN102507918B和CN104198725B公开的试剂盒检测灵敏度均大于等于1.25AU/ml，线性测量范围均在200AU/ml以下，均难以满足临床的检测需求。因此，有必要开发一种同时具有高灵敏度和宽线性范围的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒。
技术实现思路
针对现有抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒在测试过程中存在的上述缺陷，本专利技术提供一种快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好、液体双试剂操作简便适用于临床全自动或半自动生化分析的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒。本专利技术涉及一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒，包含试剂R1、试剂R2和校准品，其中试剂R1包含生物缓冲剂、促凝剂、表面活性剂、渗透压调节剂和水，试剂R2包含包被抗环瓜氨酸肽抗原的乳胶颗粒、生物缓冲剂、封闭剂、防腐剂和水，校准品包含抗环瓜氨酸肽抗体、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖和Proclin300。其特征在于，所述试剂R2中抗环瓜氨酸肽抗体的乳胶颗粒的粒径为0.5-1.5μm，优选为0.8-1.3μm。优选地，试剂中生物缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷、MES、磷酸盐、MOPSO、DIPSO中的一种或几种；促凝剂为聚乙二醇-200-10000或葡聚糖4000-12000中的一种或几种；表面活性剂为曲拉通X-100或吐温-20中的一种；渗透压调节剂为氯化钠；封闭剂为牛血清蛋白；防腐剂为叠氮化钠或硫柳汞中的一种或几种。优选地，每1升试剂R1中各组分的用量为：生物缓冲剂5-100g，促凝剂2-50g，表面活性剂1-20ml，渗透压调节剂5-20g；每1升试剂R2中各组分的用量为：包被抗环瓜氨酸肽抗原的乳胶颗粒5-20mg，生物缓冲剂5-100g，封闭剂0.2-10g，防腐剂0.2-10g。优选地，每1升试剂R1中各组分的用量为：三羟甲基氨基甲烷6.057g，聚乙二醇60004g，曲拉通X-10010ml，氯化钠10g；每1升试剂R2中各组分的用量为：包被抗环瓜氨酸肽抗原的乳胶颗粒5mg，三羟甲基氨基甲烷6.057g，牛血清蛋白1g，叠氮化钠1g。优选地，试剂R2中还包含聚六亚甲基胍和苯甲醇。优选地，试剂R2中聚六亚甲基胍的用量为0.5g/l，苯甲醇的用量为0.2g/l。本专利技术还提供了包被抗环瓜氨酸肽抗原的乳胶颗粒的制备方法，该制备方法为化学交联法：(1)用MES缓冲液将表面带有羧基功能基团、直径0.5-1.5μm的聚苯乙烯微粒稀释至终浓度为0.5-3％(wt)，加入50-90mMEDAC，混合均匀，室温震荡反应30-80分钟；(2)将步骤(1)所得混合液离心，弃上清液，用MES缓冲液清洗两次，最终胶乳微粒重悬于MES缓冲液，超声进行分散，得微粒分散液；(3)用MES缓冲液稀释抗环瓜氨酸肽抗原，与步骤(2)中微粒分散液混合，于室温反应2-4小时；(4)将步骤(3)所得反应液18000rpm离心30min后，用Tris缓冲液重悬微粒，室温封闭反应1-3小时；(5)将步骤(4)所得反应液离心，弃上清液，用Tris缓冲液清洗胶乳3次，最后用R2试本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒，其特征在于：由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成；所述试剂R1的组分包括：生物缓冲剂、促凝剂、表面活性剂、渗透压调节剂和水；所述试剂R2的组分包括：包被抗环瓜氨酸肽抗原的乳胶颗粒、生物缓冲剂、封闭剂、防腐剂和水；其特征在于：所述的乳胶颗粒为粒径0.5‑1.5μm的聚苯乙烯乳胶颗粒。

【技术特征摘要】
1.一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒，其特征在于：由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成；所述试剂R1的组分包括：生物缓冲剂、促凝剂、表面活性剂、渗透压调节剂和水；所述试剂R2的组分包括：包被抗环瓜氨酸肽抗原的乳胶颗粒、生物缓冲剂、封闭剂、防腐剂和水；其特征在于：所述的乳胶颗粒为粒径0.5-1.5μm的聚苯乙烯乳胶颗粒。2.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的生物缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷、MES、磷酸盐、MOPSO、DIPSO中的一种或几种；所述的促凝剂为聚乙二醇-200-10000或葡聚糖4000-12000中的一种或几种；所述的表面活性剂为曲拉通X-100或吐温-20中的一种；所述的渗透压调节剂为氯化钠；所述的封闭剂为牛血清蛋白；所述的防腐剂为叠氮化钠或硫柳汞中的一种或几种。3.按照权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：每1升试剂R1中各组分的用量为：生物缓冲剂5-100g，促凝剂2-50g，表面活性剂1-20ml，渗透压调节剂5-20g；每1升试剂R2中各组分的用量为：包被抗环瓜氨酸肽抗原的乳胶颗粒5-20mg，生物缓冲剂5-100g，封闭剂0.2-10g，防腐剂0.2-10g。4.按照权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：每1升试剂R1中各组分的用量为：三羟甲基氨基甲烷6.057g，聚乙二醇60004g，曲拉通X-10010ml，氯化钠10g；每1升试剂R2中各组分的用量为：包被抗环瓜氨酸肽抗原的乳胶颗粒5mg，三羟甲基氨基甲烷6.057g，牛血清蛋白1g，叠氮化钠1g。5.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴正伟，章晓庆，
申请(专利权)人：浙江夸克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33