一种竹叶兰内生真菌的分离纯化方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种竹叶兰内生真菌的分离纯化方法及其应用，属于药用植物内生菌研究领域。利用本发明专利技术的方法从云南昆明采集带土的新鲜竹叶兰样品中分离纯化得到的菌株发酵产物在抗菌、抗氧化方面具有良好作用尤其是对革兰氏阳性、阴性细菌和植物病原真菌的抑制作用，可以较好地应用于细菌感染以及农业病害防治。通过从药用植物竹叶兰的内生菌中发现活性较好地次级代谢产物，大大提高了研究效率，缩短了研究周期。本发明专利技术的方法工艺简单，效率高，并且活性较好，培养大大缩短。可用于活性单体化合物的分离及应用。

A separation of Arundina Graminifolia endophytic fungi purification method and its application

【技术实现步骤摘要】
一种竹叶兰内生真菌的分离纯化方法及其应用
本专利技术属于药用植物内生菌研究领域，具体的说，本专利技术涉及一种竹叶兰内生真菌的分离纯化，以及其发酵产物抗菌、抗氧化方面的应用，尤其是对革兰氏阳性、阴性细菌和植物病原真菌的抑制作用，可以较好地应用于细菌感染以及农业病害防治。
技术介绍
竹叶兰(Arundinagraminifolia(D.Don)Hochr.)为兰科竹叶兰属植物，别名长杆兰、百样解，是傣族常用解药，常用于治疗疮痈肿毒、毒蛇咬伤、跌打损伤等。菌根真菌可以侵入根被(皮层)组织形成内生菌根，自然界中,几乎所有的兰科植物都与真菌共生形成菌根，植物内生菌(Endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌。由于与植物协同进化，所以人们期望从内生菌内找到与宿主植物具有相同或相似的化学成分，以保护濒危药用植物物种，缩短研究周期，提高发现新药的效率。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种竹叶兰内生真菌的分离纯化方法。通过结合ITS序列比对与系统发育树归属，对其进行分子生物学鉴定，结果表明其序列与FusariumProliferatum同源性≧99％，因此，鉴定其为层出镰刀菌。本专利技术的另一目的在于提供通过上述方法获得的竹叶兰内生真菌发酵产物的应用，通过测试对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌活性，以及对菜心炭疽、稻瘟菌等14种植物病原真菌的抑菌活性，发现该真菌的次级代谢产物具有广谱抑菌性。利用DPPH法测试竹叶兰内生真菌发酵产物的抗氧化性能，发现其具有很好的抗氧化性。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种竹叶兰内生真菌的的分离纯化方法，所述竹叶兰是在云南采集的无病虫害的新鲜野生竹叶兰；所述分离方法中，消毒酒精的浓度为75％，次氯酸钠溶液的浓度为1％，消毒时间为2～5min，所用固体培养基采用改良PDA固体培养基。优选的，培养基采用PDA综合固体培养基，能够分离得到更多的内生真菌；一种竹叶兰内生真菌的的分离纯化方法，包括如下步骤：(1)采样：从云南昆明采集带土的新鲜竹叶兰样品，装入密封袋，低温保存；(2)消毒处理：新鲜竹叶兰放在流动的自来水下面冲洗干净，用无菌滤纸擦干通过经典的表面消毒法对竹叶兰的根、茎、叶进行消毒处理；根、茎、叶：自来水表面清洗4～5次→消毒纸巾吸干水分→75％酒精漂洗2min→无菌水冲洗3次→消毒纸巾吸干水分→1％次氯酸钠溶液漂洗5min→无菌水冲洗3次→消毒纸巾吸干水分(叶片仅用酒精消毒)；(3)培养：无菌条件下将叶片切成5mm×5mm大小，根、茎切成5mm长度，置于改良PDA固体培养基平板上28℃避光恒温培养；最后一次冲洗无菌水设为对照培养，若无菌落生长则说明样品消毒彻底；(4)纯化：将所得到的内生真菌分别转接至改良PDA固体培养基，根据菌落的颜色、形态不同，挑取单菌落，反复培养、纯化，得到纯菌株TJ-3，名称为层出镰刀菌(FusariumProliferatum)TJ-3；(5)保存菌种：将纯化后的真菌菌丝用无菌水轻轻洗脱，菌丝及孢子悬浮液按1:1的比例与50％的甘油混匀，-20℃保存(长期保存)；同时把真菌菌丝挑取至改良PDA固体斜面培养基上培养，4～5d后，置于5℃冰箱保存(1～2月转接一次)；优选的，步骤(3)、(4)、(5)中所用到的改良PDA固体培养基是在标准PDA固体培养基的基础上加入适量微量元素进行改良的，配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，七水硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3.0g，维生素B150mg，琼脂20g，水1000mL，自然pH。TJ-3发酵产物的制备，即对TJ-3菌株进行液体扩大培养，包括如下步骤：1)扩大培养：将在改良PDA固体斜面培养基上培养好的真菌菌落，用无菌水冲洗，轻轻刮取菌丝，按10％的接种量接种至液体发酵培养基中，28℃，转速采用100～200rpm，培养3～10天，得到TJ-3发酵液；2)菌丝菌液分离：在漏斗中用8层纱布过滤TJ-3发酵液，得到TJ-3菌丝和TJ-3菌液，其中菌丝放入70℃烘箱烘干，菌液放置在水浴锅上浓缩；3)活性测试的供试液：菌丝用适量甲醇浸泡提取3次，得到TJ-3菌丝的甲醇浸泡液；浓缩后的菌液用等体积的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，得到各部位的萃取液，即发酵液二氯甲烷部位、发酵液乙酸乙酯部位、发酵液正丁醇部位；蒸干备用；优选的，步骤1)中所述的液体发酵培养基配方为：碳源：MgSO4·7H2O(0.5g/L)，KH2PO4(1.0g/L)，Glucose(38.5g/L)，VB1(50mg/L)，调pH5.5；氮源：鱼粉蛋白胨(5g/L)，酵母提取物(2.5g/L)，115℃，30min高温灭菌，使用时把氮源按10％的量加入碳源中混匀。优选的，步骤1)中所述的转速采用160r/min，培养时间为7天。TJ-3发酵产物的抑细菌菌活性测试，包括如下步骤：以大肠杆菌(Escherichiacoli)CMCC44825和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC29213为供试菌，通过滤纸片法进行抑细菌活性测试：取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液接种于牛肉膏-蛋白胨液体培养基内活化12h，37℃，160rpm，然后用牛肉膏-蛋白胨液体培养基稀释100倍，使得细菌浓度为105个/mL，取稀释好的菌液200μL，均匀涂布在牛肉膏-蛋白胨固体培养基上，表面稍微干燥后，均匀放置蘸取药液的无菌滤纸片，每种药液重复2次(样品液的浓度均为10mg/mL)，其中药液分别为：发酵液二氯甲烷部位、发酵液乙酸乙酯部位、发酵液正丁醇部位、菌丝甲醇浸泡液、竹叶兰乙酸乙酯部位(干燥竹叶兰用85％乙醇溶液提取，提取液浓缩后，依次用石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇萃取，得到各萃取部位，经实验表明，竹叶兰的大多数活性成分都存在于乙酸乙酯萃取部位)、发酵液粗提物(TJ-3菌液浓缩干燥后所得)、氨苄青霉素钠(100μg/L，阳性对照)、水(阴性对照)，封口膜封口，37℃下，静置培养24h，观察抑菌圈大小。TJ-3发酵产物的抑真菌活性测试，包括如下步骤：以菜心炭疽菌(Colletolrichumhigginsianum)、黄瓜疫霉(PhytophthoramelonisKatsura)、苦瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.momdicaeSun&Huang)RRs-3-2-03、稻瘟菌(Magnaportheoryzae)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、落花生球腔菌(Mycosphaerellaarachidicola)、小白菜炭疽(Colletotrichumhigginsianum)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、长柄链格孢菌(Alternarialongipes)、柑橘白地霉(Geotrichumcitri-aurantii)、柑橘灰霉菌(Botrytiscinerea)、柑橘囊胞壳菌(Phytophthoracapsici)、猕猴桃拟茎点霉(Phomopsissp.)、猕猴桃葡萄座腔菌(Botryosphaeriaparva)共14种病原真菌为供试菌，通过平板对峙法，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种竹叶兰内生真菌的的分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤：(1)采样：从云南昆明采集带土的新鲜竹叶兰样品，装入密封袋，低温保存；(2)消毒处理：新鲜竹叶兰放在流动的自来水下面冲洗干净，用无菌滤纸擦干通过经典的表面消毒法对竹叶兰的根、茎、叶进行消毒处理；根、茎、叶：自来水表面清洗4～5次→消毒纸巾吸干水分→75％酒精漂洗2min→无菌水冲洗3次→消毒纸巾吸干水分→1％次氯酸钠溶液漂洗5min→无菌水冲洗3次→消毒纸巾吸干水分；其中，叶片仅用酒精消毒；(3)培养：无菌条件下将叶片切成5mm×5mm大小，根、茎切成5mm长度，置于改良PDA固体培养基平板上28℃避光恒温培养；最后一次冲洗无菌水设为对照培养，若无菌落生长则说明样品消毒彻底；(4)纯化：将所得到的内生真菌分别转接至改良PDA固体培养基，根据菌落的颜色、形态不同，挑取单菌落，反复培养、纯化，得到纯菌株TJ‑3，名称为层出镰刀菌(Fusarium Proliferatum)TJ‑3。

【技术特征摘要】
1.一种竹叶兰内生真菌的的分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤：(1)采样：从云南昆明采集带土的新鲜竹叶兰样品，装入密封袋，低温保存；(2)消毒处理：新鲜竹叶兰放在流动的自来水下面冲洗干净，用无菌滤纸擦干通过经典的表面消毒法对竹叶兰的根、茎、叶进行消毒处理；根、茎、叶：自来水表面清洗4～5次→消毒纸巾吸干水分→75％酒精漂洗2min→无菌水冲洗3次→消毒纸巾吸干水分→1％次氯酸钠溶液漂洗5min→无菌水冲洗3次→消毒纸巾吸干水分；其中，叶片仅用酒精消毒；(3)培养：无菌条件下将叶片切成5mm×5mm大小，根、茎切成5mm长度，置于改良PDA固体培养基平板上28℃避光恒温培养；最后一次冲洗无菌水设为对照培养，若无菌落生长则说明样品消毒彻底；(4)纯化：将所得到的内生真菌分别转接至改良PDA固体培养基，根据菌落的颜色、形态不同，挑取单菌落，反复培养、纯化，得到纯菌株TJ-3，名称为层出镰刀菌(FusariumProliferatum)TJ-3。2.根据权利要求1所述的竹叶兰内生真菌的的分离纯化方法，其特征在于：步骤(3)、(4)中所用到的改良PDA固体培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，七水硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3.0g，维生素B150mg，琼脂20g，水1000mL，自然pH。3.根据权利要求1所述的竹叶兰内生真菌的的分离纯化方法，其特征在于：TJ-3发酵产物的制备，即对TJ-3菌株进行液体扩大培养，包括如下步骤：1)扩大培养：将在改良PDA固体斜面培养基上培养好的真菌菌落，用无菌水冲洗，轻轻刮取菌丝，按10％的接种量接种至液体发酵培养基中，28℃，转速采用100～200rpm，培养3～10天，得到TJ-3发酵液；2)菌丝菌液分离：用8层纱布过滤TJ-...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘美凤，汤冰雪，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44