一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法，所述方法包括如下步骤：(1)取培养成熟的黑曲霉麸曲孢子，得到分散孢子悬液；(2)培养步骤(1)中的分散孢子悬液，得到发芽孢子；(3)发芽孢子重新分散，种子罐内培养，得到成熟种子液；(5)成熟种子液转至发酵罐内培养发酵，得到柠檬酸发酵液。本发明专利技术解决了孢子萌发过程中聚集的问题，提高孢子成球率，增加菌丝球数量，有效控制菌丝球的大小均一性，提高菌体的转化效率，发酵转化率提高，发酵周期缩短。

A method for the cultivation of Aspergillus niger seeds and the preparation of citric acid

The invention discloses a Niger seed culture and preparation method of citric acid, the method comprises the following steps: (1) cultured mature spores of Aspergillus niger koji, dispersed spore suspension; (2) training steps (1) dispersed spore suspension of spore germination was (; 3) re dispersed spore germination, seed cultivation tank, mature seed liquid; (5) fermentation liquid to mature seeds in the fermentation tank, from citric acid fermentation liquid. The invention solves the problem of aggregation during spore germination, improve spore granulation rate, increase the number of pellets, the size uniformity of the effective control of mycelial pellets, improve the conversion efficiency of the cell, fermentation conversion rate, shorten the fermentation period.

【技术实现步骤摘要】
一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法
本专利技术涉及微生物发酵
，尤其是涉及一种利用特殊培养的黑曲霉种子液制备柠檬酸的方法。
技术介绍
柠檬酸是一种重要的有机酸，又名枸橼酸，无色无臭，有很强的酸味，易溶于水，在工业，食品业，化妆业等具有极广泛的用途。目前，柠檬酸主要通过发酵法生产获得，以玉米等淀粉质农作物作为原料。传统柠檬酸发酵通常是先进行黑曲霉孢子扩培，得到成熟的孢子；然后孢子接入种子培养基中获得成熟的种子液；最后将种子液移入发酵培养基中发酵得到柠檬酸发酵液。传统种子培养通常需要24-32h，培养周期较长。而在种子培养过程中，前期0-8h主要是黑曲霉孢子吸水膨胀，孢子萌发，恢复代谢活动的过程，8h后才进入菌丝生长的阶段。前期孢子吸水膨胀到萌发，几乎不消耗营养物质，只需要少量营养物质促进其恢复代谢活力；另外几乎不消耗溶解氧，对搅拌、转速、风量要求低；而菌丝生长阶段则需要消耗大量的营养物质和溶氧，并且pH会逐渐下降至2.0以下。传统种子培养过程中，孢子萌发和菌丝生长均在种子罐内，种子罐培养时间增加1/3，降低种子罐利用率，增加前期能耗。另外，由于孢子间存在电荷吸附作用，分散的孢子容易重新聚集成团，结团后多个孢子只能形成一个菌丝球，导致孢子形成菌丝球的比例降低，传统种子培养过程中孢子成球率只有60％；而且菌丝球大小不均一，部分菌丝球直径偏大，中心形成致密区，无法与营养物质和氧气有效接触，导致菌体转化效率降低。因此，如何改进黑曲霉种子培养方法，缩短种子培养时间，提高种子罐利用率；以及提高孢子成球率，和控制菌丝球均一性是柠檬酸发酵生产中亟待解决的一个重要问题。
技术实现思路
针对传统技术存在的上述问题，本专利技术申请人提供了一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法。本专利技术方法将黑曲霉孢子萌发与菌丝体生长两阶段分开培养，孢子萌发在小容器中进行，孢子萌发后转接至种子罐内进行菌丝生长，缩短种子培养时间，提高种子罐利用率。本专利技术解决了孢子萌发过程中聚集的问题，提高孢子成球率，增加菌丝球数量，有效控制菌丝球的大小均一性，提高菌体的转化效率，发酵转化率提高，发酵周期缩短。本专利技术的技术方案如下：一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法，包括如下步骤：(1)取培养成熟的黑曲霉麸曲孢子，加入5～10倍体积的无菌水，震荡浸泡0.5～12h，用四层纱布过滤，得到分散孢子悬液；(2)将步骤(1)中的分散孢子悬液接入稀糖液中，在温度为30～42℃，pH为3.5～6.0，搅拌转速为0～100rpm的条件下，培养4～10h，得到发芽孢子；所述稀糖液中含有麸皮或淀粉渣颗粒物质，使得固形物含量为10～100g/L，另外，稀糖液中添加体积百分比为0.05～0.1％的吐温80；(3)培养结束后，将搅拌转速提高至200～1000rpm，搅拌0.5～2h，将聚集的发芽孢子重新分散；(4)将步骤(3)中分散的发芽孢子，转接至种子罐内，在温度为35～39℃，风量为0.2～0.6vvm，罐压为0.05～0.1Mpa，搅拌转速为100～200rpm的条件下，培养10～16h，得到成熟种子液；(5)将步骤(4)中成熟种子液转至发酵罐内培养，还原糖低于5g/L停止发酵，得到柠檬酸发酵液。步骤(2)中所述接入孢子悬液的终浓度为3*109～6*109个/mL。步骤(2)中所述稀糖液是由玉米液化液经过板框过滤得到糖液，再将糖液稀释至总糖浓度5～20g/L；所述121℃灭菌15min，冷却至39℃获得。步骤(2)中所述稀糖液还可以选择直接利用玉米液化液稀释，并121℃灭菌15min，冷却至39℃获得。步骤(2)中所述颗粒物质采用发酵行业其他含有纤维、淀粉或蛋白的颗粒物质替代。步骤(4)中所述种子罐内种子培养基为：采用玉米液化液和硫酸铵配制，总糖浓度100～160g/L，氮源浓度为2～3g/L，121℃灭菌15min，冷却至39℃。步骤(5)中所述发酵罐内发酵培养基为：采用玉米液化液和糖液配制，总糖浓度160～170g/L，氮源浓度为0.9～1.2g/L，90℃灭菌25min，冷却至37℃。所述发酵培养基还添加小麦淀粉乳或木薯液化液。于步骤(5)中所述发酵培养条件为：培养温度35～39℃，风量为0.1～0.4vvm，罐压0.05～0.1Mpa，搅拌转速100～200rpmin。本专利技术有益的技术效果在于：本专利技术申请采用柠檬酸生产中的糖液对孢子进行培养，培养过程在较低的pH下，也能顺利进行。本专利技术将黑曲霉孢子萌发与菌丝体生长两阶段分开培养，先在小容器中诱导孢子快速萌发，然后转接至种子罐内进行菌丝生长，缩短种子培养时间，提高种子罐利用率。本专利技术在孢子萌发过程添加适量吐温80表面活性剂，防止孢子聚集；添加适量颗粒物质(麸皮、淀粉渣等含颗粒物质)增加孢子萌发附着点，增加孢子聚集的阻力；孢子培养结束后进行高搅拌转速处理，将聚集的孢子重新打散后，再接入种子罐内培养。孢子成球率从61％提高至80％以上，菌丝球数量从2.5*105增加至3.3*105个/毫升，有效控制菌丝球的大小均一性。采用本专利技术获得的种子液，菌丝球大小一致，改善了菌体的传质和溶氧，提高了菌体的转化效率，在发酵浓度相近的情况下，发酵转化率提高1.1个百分点，发酵周期缩短4h，发酵强度提高8.3％。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术进行具体描述。以下实施例和对比例所涉及原料和试剂均为市售商品；黑曲霉菌来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保藏编号CICC40021。总糖、还原糖测定均采用菲林滴定法，氮源测定采用凯氏定氮法，柠檬酸测定采用0.1429mol/L的NaOH滴定，孢子计数采用血球计数板。如无特殊说明，均采用本领域常用设备和工艺方法。实施例1原料处理：将玉米进行粉碎后，过60目筛；所得玉米粉与自来水按1:3的质量比混合均匀，用Ca(OH)2将粉浆pH调至6.0，按20U/g玉米粉的添加量加入诺维信α-高温淀粉酶；所得粉浆先经过97℃喷射，保温1.5h后再经过127℃喷射，经过闪蒸将料液温度降至95℃，保温1h，碘试呈浅棕色后得到合格玉米液化液；将80％的玉米液化液经过板框过滤去掉滤渣，得到糖液。孢子培养：取培养成熟的黑曲霉麸曲孢子，加入5倍体积的无菌水，震荡浸泡0.5h，用四层纱布过滤，得到分散孢子悬液，将玉米液化液经过板框过滤得到的糖液加水稀释至总糖浓度5g/L；加入麸皮，使固形物浓度达到10g/L，加入0.05％(v/v)体积的吐温80，将pH调至3.5；在121℃灭菌15min，冷却至39℃，接入孢子悬液，使得孢子终浓度为3*109个/mL，在温度30℃，不开启搅拌的条件下培养10h后，将搅拌转速调至200rpm，搅拌0.5h，得到出芽孢子悬液。种子培养：种子培养基采用玉米液化液和硫酸铵配制，总糖浓度控制100g/L，氮源浓度控制2g/L，121℃灭菌15min，冷却至39℃，接入出芽孢子悬液；种子培养温度为35℃，风量为0.2vvm，罐压为0.05Mpa，搅拌转速为100rpm，培养10h获得成熟种子液。发酵培养：发酵培养基采用玉米液化液和糖液配制，总糖浓度控制160g/L，氮源浓度控制0.9g/L，90℃灭菌25min，冷却至37℃接入种子，发酵培养温度为35℃，风量为0.1vvm，罐压本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：(1)取培养成熟的黑曲霉麸曲孢子，加入5～10倍体积的无菌水，震荡浸泡0.5～12h，用四层纱布过滤，得到分散孢子悬液；(2)将步骤(1)中的分散孢子悬液接入稀糖液中，在温度为30～42℃，pH为3.5～6.0，搅拌转速为0～100rpm的条件下，培养4～10h，得到发芽孢子；所述稀糖液中含有麸皮或淀粉渣颗粒物质，使得固形物含量为10～100g/L，另外，稀糖液中添加体积百分比为0.05～0.1％的吐温80；(3)培养结束后，将搅拌转速提高至200～1000rpm，搅拌0.5～2h，将聚集的发芽孢子重新分散；(4)将步骤(3)中分散的发芽孢子，转接至种子罐内，在温度为35～39℃，风量为0.2～0.6vvm，罐压为0.05～0.1Mpa，搅拌转速为100～200rpm的条件下，培养10～16h，得到成熟种子液；(5)将步骤(4)中成熟种子液转至发酵罐内培养，还原糖低于5g/L停止发酵，得到柠檬酸发酵液。

【技术特征摘要】
1.一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：(1)取培养成熟的黑曲霉麸曲孢子，加入5～10倍体积的无菌水，震荡浸泡0.5～12h，用四层纱布过滤，得到分散孢子悬液；(2)将步骤(1)中的分散孢子悬液接入稀糖液中，在温度为30～42℃，pH为3.5～6.0，搅拌转速为0～100rpm的条件下，培养4～10h，得到发芽孢子；所述稀糖液中含有麸皮或淀粉渣颗粒物质，使得固形物含量为10～100g/L，另外，稀糖液中添加体积百分比为0.05～0.1％的吐温80；(3)培养结束后，将搅拌转速提高至200～1000rpm，搅拌0.5～2h，将聚集的发芽孢子重新分散；(4)将步骤(3)中分散的发芽孢子，转接至种子罐内，在温度为35～39℃，风量为0.2～0.6vvm，罐压为0.05～0.1Mpa，搅拌转速为100～200rpm的条件下，培养10～16h，得到成熟种子液；(5)将步骤(4)中成熟种子液转至发酵罐内培养，还原糖低于5g/L停止发酵，得到柠檬酸发酵液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述接入孢子悬液的终浓度为3*109～6*109个/mL。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：石贵阳，刘龙，陈坚，胡志杰，蒋建伟，蒋小东，金赛，孙福新，李由然，周东姣，
申请(专利权)人：江苏国信协联能源有限公司，江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32