来自曲霉的内切β-1,4-葡聚糖酶制造技术

一种从曲霉属获得的酶，其中该酶具有下面的特征： ａ．ＭＷ是２４２３５Ｄ±５０Ｄ ｂ．ｐＩ大约是４ ｃ．葡聚糖酶活性 其中所述葡聚糖酶活性是内切β－１，４－葡聚糖酶活性。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,4－葡聚糖酶的制作方法
本专利技术涉及一种酶，另外，本专利技术涉及编码这种酶的核苷酸序列。本专利技术也涉及一启动子，该启动子被用来控制编码所述酶的所述核苷酸序列的表达。具体地说，本专利技术所述的酶是一种葡聚糖酶-即一种能降解β-1，4-糖苷键的酶。已知希望在生物体-如丝状真菌(如黑色曲霉(Aspergillus Niger))或者甚至一种农作物的一些组织中指导所感兴趣的基因(“GOI”)的表达。产物蛋白质或者酶对于生物体本身可以是有用的。例如，可能希望产生有优化的氨基酸组成的作物蛋白产物，以提高作用的营养价值。例如，这种作物可以制成更有用的饲料。或者，可能希望分离产物蛋白质或酶，然后使用这种蛋白质或酶来制备，例如，食品组合物。从这一点来看，该产物蛋白质或酶可以食品组合物的一个成分，或者它可以被用来制备食品组合物，包括改变食品组合物的性质或外观。甚至可能希望使用生物体，如一种丝状真菌或者一种农作物，为了相同的目的来表达非植物基因。也可能希望使用一种生物体如一种丝状真菌或一种农作物，来表达哺乳动物基因。后者产物的例子包括干扰素、胰岛素、血因子和血纤蛋白溶酶原激活物。也希望使用微生物，如丝状真菌，通过使用在该微生物中有活性的启动子，由GOI制备产品。水果和蔬菜细胞壁大多由多糖组成，主要成分是果胶、纤维素和木糖葡聚糖(R.R.Selvendran和J.A.Rogbertson，IFR报告(IFRReport)，1989)。已经提出过多种细胞壁模型，努力加入强度和柔性基本性质(P.Albersheim，美国科学(Sci.Am.)，232，81-95，1975，P.Albersheim，植物生物化学(Plant Biochem.)第三版(Bonner和Varner)，Ac.Pross，1976；T.Hayashi植物生理及植物分子生物学年度综述(Ann.Rev.Plant Physiol & Plant Mol Biol，40，139-168，1989)。植物细胞壁的组成复杂而多样。发现多糖主要以长链纤维素(植物细胞壁的主要结构成分)，半纤维素(含有多种β-木聚糖链，例如木葡聚糖(xyloglucans))和果胶物质(由半乳糖醛聚糖(galacturonan)和鼠李糖半乳糖醛聚糖(thamnogalacturonan)；阿拉伯聚糖和半乳聚糖及阿拉伯半乳聚糖组成)的形式。具体地说葡聚糖专一性地由葡萄糖亚基组成。葡聚糖典型的例子是淀粉和纤维素。降解葡聚糖的酶总称为葡聚糖酶。一种典型的葡聚糖是β-1，4-内切葡聚糖酶。β-1，4-内切葡聚糖已经应用于多种工业。例如酿酒业，在近些年，作为酿酒过程中的副产物，大麦用于生产啤酒。当啤酒质地不好，或者大麦作为副产物被使用时，因为来自大麦的β-葡聚糖而产生麦芽汁中高粘度问题。就这一点来说，大麦含有大量非常高分子量的混合的β-1，3/1，4-葡聚糖。溶解时这些葡聚糖产生高粘度溶液，这在一些应用中带来麻烦。例如，高粘度降低了麦芽汁的可过滤性，并带来不可接受的长过滤时间。为避免这些问题，传统上向麦芽汁中加入β-葡聚糖酶来避免这些问题-即葡聚糖带来的问题可以通过加入酶，特别是葡聚糖酶(其降解该聚合物)而避免。有关这些问题的其它信息可以参见C.W.Bamforth博士写的综述，Grindsted手册，名为《葡聚糖酶GV》(“Glucanase GV”)(BrewersDigest，1982年6月，pp.22-28；和Brewers’Guardian，1985年9月，pp.21-26)，和T.Godfrey的文章(《工业酶学-酶在工业上的应用》(Industrial Enzymology The Application of Enzymes)，第4.5章，pp.221-259)。在食品工业中，由于大麦价廉而被用来制造鸡饲料，但还是β-葡聚糖带来鸡消化不食问题。通过向食物中加入β-葡聚糖酶可以提高食物的可消化性。而且喂食含大麦食品的鸡的排泄物有粘性，使其不易去除而使产蛋肮脏。WO 93/2019讨论了内切-β-1，4-葡聚糖酶(EC no.3.2.1.4)。根据WO 93/2019，这些萄聚糖酶是一组水解酶，其催化纤维素，地衣淀粉，谷物β-D-葡聚糖和其它含纤维素部分的植物材料中1，4-β-D-糖苷键的内切水解。内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖基水解酶有时称作内切-β-1，4-葡聚糖酶。WO 93/2019中的内切-β-1，4-葡聚糖酶具有最适pH为2.0至4.0，等电点是2.0至3.5，分子量在30,000和50,000之间，最适温度在30和70℃之间。有关葡聚糖，特别是木糖基葡聚糖(xyloglucan)的进一步教诲可以参见WO 93/17101。根据WO 93/17101，木糖基葡聚糖是被α-1，6-木糖基侧链广泛取代的，其中一些是1，2-β-半乳糖基化的。其大量发现于双子叶的初生细胞壁中，但在一些种子中也有发现，它们在其中起各种各样的作用。初生细胞壁木糖基葡聚糖是岩藻糖基化物的。木糖基葡聚糖紧密地氢键键合于纤维素微纤维，需要浓碱或强的溶胀剂才能释放它。据认为木糖基葡聚糖在纤维素微纤维之间形成交联桥，这种纤维素/木糖基葡聚糖网络形成该细胞壁主要的负载/弹性网络。DCB突变悬浮培养细胞(细胞壁缺乏纤维素)将木糖基葡聚糖释放到它们的培养基中，说明木糖基葡聚糖一般当然与纤维素键联。在IAA诱导生长中，初生细胞壁的水解已在压片胚轴无光生长的区段中得已证实(K.Waka bayashi等，植物生理学(Plant Physiol.，95，1070-1076，1991)。据认为壁木糖基葡聚糖内切水解与伴随细胞膨胀的壁松散有关(T.Hyashi，植物生理学和植物分子生物学年度综述(Ann.Rev.Plant Physiol&Plant Mol.Biol.)，40，139-168，1989)。木糖基葡聚糖的平均分子量也呈示出在蕃茄果实成熟过程中降低，而且这可能与伴随成熟过程中组织变软有关(D.J.Huber，J.Amer.Soc.Hort Sci.，108(3)，405-409，1983)。一些种子，例如Masturtium，含有最多30％重量的木糖基葡聚糖，储存在加厚的子叶细胞壁中，其作用是储存多糖，并在发芽期间快速解聚。提高葡聚糖酶活性，例如优选使用重组DNA技术获得用于食物的有高浓度葡聚糖酶的植物，这一点是有用的。本专利技术试图提供一种具有葡聚糖酶活性的酶；优选其中这种酶能例如仅在一种生物体，一般为一丝状真菌，优选为曲霉属，如黑色曲霉的一些或特定细胞或组织中制得，或者甚至是一种植物的特定细胞或组织中制得。本专利技术也试图提供一种编码这种酶的GOI，这种GOI能优选在一种生物体，一般为丝状真菌，优选为曲霉属，如黑色曲霉，特定细胞或组织中表达，或者甚至是一种植物的一些或特定细胞或组织中表达。此外，本专利技术试图提供一种能指导GOI表达的启动子，例如优选在某些特定细胞或组织，例如仅在一种生物体，一般为丝状真菌，优选为曲霉属，如黑色曲霉，或者甚至是一种植物的特定细胞或组织中编码本专利技术酶的核苷酸序列。优选在曲霉属中使用这种启动子，其中由GOI编码的产物从宿主生物体分泌到周围基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：S·M·马德里，P·拉斯慕森，A·巴鲁赫，
申请(专利权)人：丹尼斯科有限公司，
类型：发明
国别省市：