ERBB2‑R113Q突变基因用于制备评判乳腺癌遗传易感性试剂盒的应用制造技术

本发明专利技术涉及ERBB2‑R113Q突变基因用于制备乳腺癌易感性评估试剂盒的应用。本发明专利技术还涉及乳腺癌风险评估试剂盒，该试剂盒包括根据ERBB2‑R113Q突变基因设计的PCR引物。本发明专利技术提供了中国人群中存在ERBB2基因的一种突变，并且说明了该突变基因与乳腺癌的发病风险相关。利用本发明专利技术的试剂盒检测方法简单、成本低，检测结果直接、可靠，适用于对有肿瘤家族史的病人及其亲属ERBB2基因R113Q的大规模的筛查和癌症易感性评估。

ERBB2 mutation of R113Q gene in application for preparing evaluation of breast cancer susceptibility Kit

【技术实现步骤摘要】
ERBB2-R113Q突变基因用于制备评判乳腺癌遗传易感性试剂盒的应用
本专利技术属于医学和生物技术，具体涉及一种乳腺癌遗传易感基因检测试剂盒。
技术介绍
乳腺癌是目前女性最常见的恶性肿瘤，是全球女性死亡的第二大原因。自1990年以来，中国的乳腺癌发病率增长速度是全球的两倍以上。据肿瘤登记中心的数据显示，截至2011年，乳腺癌已连续11年位居我国女性的癌症发病率之首。中国占据新诊断乳腺癌病例的11.2％，占据乳腺癌死亡的9.2％，中国每年约有近20万乳腺癌患者，严重威胁着我国女性的健康，因此，乳腺癌的早期诊断及有效的治疗显得尤为重要。乳腺癌属于复杂疾病的一种，乳腺癌的病因至今尚未明确揭示，随着肿瘤分子遗传学、肿瘤细胞遗传学和分子流行病学的发展，目前认为环境因素和遗传因素共同作用影响乳腺癌的发生，在遗传性癌综合征中，癌相关基因的种系突变决定了该家族的肿瘤遗传易感性；而在散发性癌症中，主要危险因素是环境因子，与此相关基因的遗传多态性决定了个体对这些因素的易感性。有研究表明携带乳腺癌遗传易感基因的女性，乳腺癌的发病风险将会大大提高，以BRCA1和BRCA2基因为例，携带者终生患乳腺癌的风险高达80％，因此针对这些与乳腺癌相关的易感基因的检测可提高乳腺癌的二级预防(早发现、早诊断、早治疗)。
技术实现思路
本专利技术通过对117例有肿瘤家族史的乳腺癌病人及250名正常的对照成员ERBB2基因R113Q进行筛查，该变异在乳腺癌患者中发生频率显著高于正常对照，说明该突变位点与乳腺癌密切相关。基于上述发现，本专利技术提供了ERBB2-R113Q(rs185670819)突变基因用于制备乳腺癌易感基因筛查试剂盒的应用。本专利技术还提供了一种乳腺癌易感基因筛查，所述试剂盒包括根据ERBB2–R113Q突变基因设计的PCR引物。一种实施方式中，本专利技术的根据ERBB2-R113Q突变基因设计的PCR引物为：ERBB2-R113Q-F：5'-ACGTGCTCATCGCTCACAAC-3'；ERBB2-R113Q-R：5'-CCCAGAAGGGACACCATTTC-3'。一种实施方式中，本专利技术的试剂盒包括：20ul10XPCR缓冲液，4ul10mMdNTP混合液，2ul5unit/ul的TaqDNA聚合酶，10ul10pmol/ulERBB2-R113Q-F：5'-ACGTGCTCATCGCTCACAAC-3'，10ul10pmol/ulERBB2-R113Q-R：5'-CCCAGAAGGGACACCATTTC-3'。本专利技术的一个实施方案中提供一个检测ERBB2基因变异的试剂盒，本试剂盒内装有用以检测ERBB2基因rs185670819的成分，与之同时提供可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品中ERBB2基因突变位点的试剂盒，可含有扩增引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液、测序反应所需试剂等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述引物可以采用上述的一对ERBB2-R113Q-F和ERBB2-R113Q-R引物，所述的用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。表皮生长因子2(HER2)/Neu(ERBB2)是一个重要的原癌基因，约在50％非侵袭性乳腺癌、25％的浸润性乳腺癌中高表达，在乳腺癌发生发展中具有重要功能。本专利技术通过超声医学科门诊收集有肿瘤家族史的乳腺癌患者，在患者及家属自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，建立病历资料库，详细记录患者病情、家系中发病情况以及联系方式。然后应用酚氯仿抽提方法提取基因组DNA，定量后入库，-20℃保存，每份DNA均准确对应登记的患者临床资料。根据专利技术人前期对有肿瘤家族史的乳腺癌患者基因研究，专利技术人发现在一些患者中存在相同的ERBB2-R113Q变异，所以专利技术人根据PrimerPremier5.0进行设计引物，包含ERBB2基因R113Q位点及两侧序列，进行PCR扩增。对PCR产物进行直接测序：测序引物与PCR扩增引物相同，应用ABI公司3730DNA测序仪进行正反向测序。将得到的序列与Genbank中的标准序列比对，确定R113Q变异位点。按正常阅读框进行翻译以确定ERBB2基因突变位点。以有肿瘤家族史的乳腺癌病人作为研究对象，通过对117例乳腺癌病人及200例正常对照的ERBB2基因的ERBB2-R113Q进行筛查，发现8名患者在具有ERBB2-R113Q基因型(6.8％)。该变异为一个错义变异。这个变异在200例对照组中仅3名携带(1.2％)，相对危险度OR＝6.12，说明这一变异位点增加乳腺的患病风险。本专利技术提供了中国人群中存在ERBB2基因的胚系变异，并且说明了该基因变异与乳腺癌的遗传易感性相关。同时，利用本专利技术的试剂盒检测方法简单、成本低，检测结果直接、可靠，适用于对乳腺癌ERBB2基因rs185670819的大规模的筛查和遗传易感性的诊断。附图说明图1为ERBB2基因rs185670819位点部分测序结果，(B)为野生型即未发生突变的碱基序列；(A)为杂合型即发生碱基变异的序列。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步叙述，以使公众对
技术实现思路
有更深入的了解，并非对本专利技术的限制，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。凡依照本专利技术公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本专利技术的保护范围。实施例1：ERBB2基因rs185670819的检测方法制备基因组DNA模板抽取受试者外周血，用酚氯仿抽提法提取DNA第一天1.在抗凝剂EDTA存在下，将收集的5-10ml人外周血在2500rpm，离心分离30分钟除去血清；2.加入0.2％NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟；3.在2500rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物；4.用0.2％的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤；5.在如此获得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mMEDTA(4ml)，以悬浮该沉淀物；6.将10％SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16ul和20ul，接着上下颠倒悬液轻轻混合；7.在37℃过夜温育悬液。第二天1.加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物；2.以3000rpm进行离心分离10分钟除去水层；3.将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000rpm离心分离10分钟；4.除去水层，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10，3MNaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀；5.用70％的乙醇洗涤以获得基因组DNA；6.使这样获得的DNA，基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率；7.DNA工作液浓度校正至50ng/ul，置-20℃冰箱保存。二.ERBB2基因rs185670819的PCR扩增1.引物序列上游引物：ERBB2-R113Q-F：5'-ACGTGCTCATCGCTCACAAC-3'本文档来自技高网...

【技术保护点】
ERBB2‑R113Q基因变异用于制备评估乳腺癌易感性的试剂盒的应用。

【技术特征摘要】
1.ERBB2-R113Q基因变异用于制备评估乳腺癌易感性的试剂盒的应用。2.一种乳腺癌风险评估试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括根据ERBB2-R113Q突变基因设计的PCR引物。3.如权利要求2所述的乳腺癌风险评估试剂盒，其特征在于：所述根据ERBB2-R113Q突变基因设计的PCR引物为：ERBB2-R113Q-F：5'-ACGTGCTCATCGCTCACAAC-3'；ERBB2-R113Q-R：5'-CCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋宏萍，刘丽文，巨艳，王立峰，舒瑞，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61