多肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多肽及其应用。所述多肽包含SEQ ID No.3中任一项所示的氨基酸序列，其能够特异性结合非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞，而不与正常的肺细胞、其他肺癌细胞及正常干细胞结合，同时其制备方法简单易行，适于规模化工业生产。本发明专利技术为肺癌干细胞的鉴定、分离及靶向治疗等提供了重要的理论和实践基础，具有广阔的应用前景。

Polypeptide and its application

The invention discloses a polypeptide and its application. The polypeptide contains the amino acid sequence of SEQ ID No.3 in any one of the specific binding to non small cell lung cancer cell line H460 in lung cancer stem cells, but not with the other normal lung cells, lung cancer cells and normal stem cells, and the preparation method is simple and easy, suitable for scale industrial production. The invention provides an important theoretical and practical basis for the identification, separation and targeting therapy of lung cancer stem cells, and has a broad application prospect.

【技术实现步骤摘要】
多肽及其应用本专利技术是申请号为201310585699.8，申请日为2013年11月19日，专利技术名称为《多肽及其应用》的分案申请。
本专利技术特别涉及一种肺癌干细胞特异性结合多肽及其应用，属于生物医药领域。
技术介绍
2008年世界卫生组织在其公布的报告中明确指出，非传染性疾病正成为人类最为致命的“杀手”，每年有大约500万人死于癌症。但整体来讲，对于肿瘤的治疗效果并不理想。主要在于肿瘤发病机理尚不清楚，例如肿瘤的起源问题。肿瘤干细胞(CancerStemCells,CSCs)理论的提出让我们看到新的希望。肿瘤干细胞理论认为肿瘤组织具有异质性，所有的肿瘤细胞中，只有很小一部分细胞具有形成并维持肿瘤生长和异质性的能力，这一小部分细胞被称作肿瘤干细胞。并且人们认为肿瘤干细胞是肿瘤起始和生长，复发和转移，以及耐药性产生的根源。对于肿瘤干细胞的研究有利于我们更好的了解肿瘤发生发展的过程和建立一种更有效的治疗策略。目前，肿瘤干细胞的研究主要依赖于分子标志物，然而多数实体瘤并没有找到特异的肿瘤干细胞分子标志物。研究人员一直期望建立一种新的策略，建立一种不依赖于特异分子标志物的鉴定和分离肿瘤干细胞方法。近些年出现的表面展示技术可以在未知细胞表面分子的情况下实现细胞特异性结合多肽的筛选。表面展示技术是利用基因工程手段实现外源多肽（或蛋白质结构域）以融合蛋白形式在微生物表面进行展示的新型基因工程技术，被展示的多肽或蛋白质结构域可以保持相对独立的空间结构和生物活性。细菌表面展示技术结合流式细胞分选技术以快速、高通量的特点为展示
中应用的热点。但是，如何利用上述表面展示技术进行肺癌干细胞特异性结合多肽筛选及进一步建立一种不依赖于特异分子标志物的鉴定和分离肿瘤干细胞的方法仍是业界亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种多肽，它包含SEQIDNo.1～SEQIDNo.3中任一项所示的氨基酸序列。本专利技术的目的之二在于提供前述多肽的衍生物，它包括：(i)SEQIDNo.1～SEQIDNo.3中任一项所示的氨基酸序列中的一个以上氨基酸残基被取代形成的多肽，或者，(ii)在SEQIDNo.1～SEQIDNo.3中任一项所示的氨基酸序列中的一个以上氨基酸残基内引入取代基团而形成的多肽，或者，(iii)权利要求1所述多肽与选定化合物融合形成的多肽，或者，(iv)将选定的附加氨基酸序列融合于SEQIDNo.1～SEQIDNo.3中任一项所示的氨基酸序列而形成的多肽。进一步的，所述多肽的衍生物包括：SEQIDNo.1～SEQIDNo.3中任一项所示氨基酸序列中的一个以上，优选1～3个，更优选1～2个，尤其优选1个保守性氨基酸残基被取代形成的、能与非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞特异性结合的多肽。进一步的，所述多肽的衍生物包含SEQIDNo.1～SEQIDNo.3中任一项所示的核心氨基酸序列，而在核心氨基酸序列两端分别连接具有X1、X2个氨基酸的肽段，其中X1、X2为0～7中的任一个整数。作为其中较为典型的案例之一，所述多肽的衍生物具有SEQIDNo.4所示的氨基酸序列。本专利技术的目的之三在于提供又一种多肽，它具有SEQIDNo.1所示的氨基酸序列，并且其中的两个半胱氨酸之间形成二硫键，构成环形多肽结构。本专利技术的目的之四在于提供前述多肽或其衍生物在制备非小细胞肺癌H460细胞系肺癌干细胞检测和/或分离试剂或试剂盒中的应用。本专利技术的目的之五在于提供前述多肽或其衍生物在制备非小细胞肺癌H460的治疗药物中的应用。本专利技术的目的之六在于提供一种分离的多核苷酸或其变异体，它能够编码前述的多肽或其衍生物。本专利技术的目的之七在于提供包含编码前述多肽或其衍生物的多核苷酸或其变异体的表达载体。本专利技术的目的之八在于提供包含前述多核苷酸或其变异体或前述载体的宿主细胞。本专利技术的目的之九在于提供一种荧光素标记的多肽，它包含：前述多肽或其衍生物，以及，用以标记所述多肽或其衍生物的荧光素分子。本专利技术的目的之十在于提供一种多肽标记的磁性粒子，它包含前述多肽或其衍生物以及磁性粒子，其中，所述磁性粒子包括磁性纳米粒子或超顺磁纳米粒子。本专利技术的目的之十一在于提供一种非小细胞肺癌H460细胞系肺癌干细胞检测和/或分离试剂或试剂盒，它包含前述多肽或其衍生物。本专利技术的目的之十二在于提供一种用于治疗非小细胞肺癌H460的药物组合物，包含可药用载体及前述多肽或其衍生物。本专利技术采用细菌随机多肽库体外展示技术和流式细胞分选技术筛选出与非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞特异性结合的细菌，经基因测序及体外细胞结合实验鉴定后，得到与肺癌干细胞特异性结合的13肽，具有SEQIDNo.1～SEQIDNo.3所示的序列，其可分别命名为“HCBP-1肽”、“HCBP-2肽”及“HCBP-3肽”。与现有技术相比，本专利技术的优点至少在于：该HCBP-1肽～HCBP-3肽，特别是其中的HCBP-1肽可与非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞特异性结合，而对正常肺成纤维细胞HLF细胞、多种肺癌细胞及人间充质干细胞无特异性结合作用，显示出多肽对肺癌肿瘤细胞的特异性选择。同时，该HCBP-1肽～HCBP-3肽的制备方法简单易行，适于规模化工业生产。本专利技术为肺癌干细胞的鉴定、分离及靶向治疗等提供了重要的理论和实践基础，具有广阔的应用前景。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1A-1B显示了非小细胞肺癌H460肿瘤干细胞的富集扩增，其中，图1A显示了细胞培养在有血清的环境中单层贴壁生长，保持分化状态。图1B显示了少量的细胞在无血清培养体系中持续分离生长，形成球状的克隆球，保持干细胞状态。图2A-2B显示了本专利技术非小细胞肺癌H460肿瘤干细胞特异性结合细菌（以下简称特异细菌，而图中所示cell是作为空白对照的肿瘤干细胞）的富集过程，其中，图2A示出了随着分选次数的增加，特异细菌对肿瘤干细胞的结合效率逐步增长，图2B示出了随着分选次数的增加，特异细菌对H460贴壁细胞的结合效率并没有增加。图3显示了本专利技术筛选所得特异细菌与肺正常成纤维细胞系HLF细胞，肺癌细胞系A549、H1299细胞，人间充质干细胞MSC细胞的结合效率均很低。图4A-4B显示了筛选出来的3个细菌克隆（分别含HCBP-1肽～HCBP-3肽）与肿瘤干细胞和贴壁H460细胞的结合情况，图4A示出了HCBP-1的细菌与肿瘤干细胞的结合效率可达52.3%，而与贴壁细胞的结合效率只有0.6%,图4B示出了HCBP-2的细菌与肿瘤干细胞的结合效率可达38.6%，而与贴壁细胞的结合效率只有0.5%。图4C示出了HCBP-3的细菌与肿瘤干细胞的结合效率可达37.2%，而与贴壁细胞的结合效率只有0.9%。图5显示了荧光显微镜鉴定肿瘤干细胞的结果，其中，富集了肿瘤干细胞的克隆球表面结合了大量FITC标记的HCBP-1多肽，而H460细胞表面仅结合了少量的HCBP-1多肽，control多肽对两种细胞结合均较低。图6A-6B显示了流式细胞仪鉴定肿瘤干细胞的结果，其中图6A显示了富集了肿瘤干细胞的克隆球细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，其特征在于，它的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征在于，它的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。2.权利要求1所述多肽在制备非小细胞肺癌H460细胞系肺癌干细胞检测和/或分离的试剂或试剂盒中的应用。3.权利要求1所述多肽在制备非小细胞肺癌H460的治疗药物中的应用。4.分离的多核苷酸或其变异体，其特征在于，它能够编码权利要求1所述的多肽。5.包含编码权利要求1所述多肽的多核苷酸或其变异体的表达载体。6.包含权利要求4所述多核苷酸或其变异体或权利要求5所述载体的宿主...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱毅敏，王安欣，
申请(专利权)人：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32