【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及一种以铁蛋白为载体的近红外二区发光材料及其构建方法和应用，尤其涉及以铁蛋白为载体的近红外二区发光材料应用于精子标记以及非梗阻性无精症临床诊断与显微取精新技术中。
技术介绍
1、曲细精管是睾丸组织功能单元，精子的发生位置，在生物发育过程中，sertoli细胞以及细胞间的紧密连接构成了血睾屏障(blood-testis barrier，btb)，用以抵御外界干扰以及形成一种免疫屏障。
2、无精子症是一类严重的男性不育症，临床上将无精子症大致归为两类：其一是因附睾梗阻或输精管堵塞导致的输精功能障碍，患者生精功能正常，称之为梗阻性无精症，多可通过手术疏堵的方式得以治疗；其二是由于睾丸固有损伤或相关激素的缺乏导致的生精功能障碍，称为非梗阻性无精症。后者是男性生殖领域最严重的一类疾病，现有研究表明部分患者睾丸组织中仍存在局部的生精位点，临床上通过手术显微取精的方式打开睾丸，截取局部的曲细精管寻找可能存在的生精灶，用于单精子显微注射，满足患者的生育需求。
3、铁蛋白(ferritin)是一类天然存在于各类生物体内的储铁蛋白，负责参与调节生物体内的铁代谢平衡，具有良好的生物相容性及生物安全性。天然存在的铁蛋白是一类具有24亚基的蛋白笼状结构，其外径12nm，内径8nm，内部空腔为水合氧化铁的磁性纳米颗粒。
4、真核生物铁蛋白通常包括两类亚基：重链(heavy chain，h)亚基和轻链(lightchain，l)亚基，对于机体不同组织器官而言，铁蛋白含h和l亚基的比例有所差异。
5、铁蛋白独特的具空腔的蛋白笼状结构使其成为天然的药物载体，根据现有报道，可通过多种方案负载不同类型的化疗药物、无机纳米颗粒、有机荧光分子及放射性同位素等。根据已有报道，可通过调节ph至2.0的方式诱导铁蛋白24亚基之间的解聚，而后通过恢复ph的方式诱导亚基之间的重新组装，铁蛋白这种强大的解聚-自组装能力使得铁蛋白成为一种独特的药物载体。2022年，jing pang等在ferritin-nanocagedatp traverses theblood-testis barrier and enhances sperm motility in an asthenozoospermiamodel.(acs nano.)中公开了铁蛋白具有特异性靶向精子头部的特性，h-铁蛋白(hfn)纳米载体具有穿越血-睾屏障(btb)的能力，并能特异性地靶向拉长的精子细胞的头部，并通过与转铁蛋白受体(tfr1)结合以在精子头部积累。tfr1在支持细胞中的表达相对较低，而在精子头部中的表达则较高。
6、本专利技术在上述技术基础上，通过采用铁蛋白负载近红外量子点的近红外影像技术标记非梗阻性无精症患者睾丸组织内的局部生精灶，从而辅助临床医生对于非梗阻性无精症临床诊断与显微取精新技术的研究，具有临床应用前景。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的是针对非梗阻性无精症的临床诊断及治疗现状，提供一种hfn负载近红外量子点的近红外二区发光材料的构建方法，基于近红外影像技术标记非梗阻性无精症患者睾丸组织内的局部生精灶，实现对于非梗阻性无精症的临床诊断及辅助显微取精新技术的研究。
2、为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：
3、首先，本专利技术提供一种以铁蛋白负载近红外量子点的近红外二区发光材料，近红外量子点装载于铁蛋白内部空腔中。
4、进一步地，所述铁蛋白为重组人源全重链铁蛋白(hfn)；或，所述铁蛋白为重组人轻链铁蛋白(lfn)。
5、进一步地，hfn的氨基酸序列如seq id no.1所示。
6、进一步地，所述近红外二区发光材料中的近红外量子点的表面带有正电荷，1个铁蛋白可负载1个近红外量子点。
7、优选地，近红外量子点的粒径大小约为6nm。
8、优选地，近红外量子点为agause qds、ag2se qds、ag2s qds、ag2te qds、agauteqds、agaus qds、ag2te：au qds；更优选地，所述近红外量子点为agause qds。
9、优选地，所述hfn的蛋白空腔大小约为8nm。
10、在优选的实施例方式中，还提供了一种编码基因，用于编码重组人源全重链铁蛋白hfn的如seq id no.2所示的核酸序列。
11、在优选的实施例方式中，还提供了携带有前述编码基因的重组表达载体。
12、本专利技术的优选的实施方式中，还提供了转化/转染有所述重组表达载体的宿主菌。
13、进一步地，所述宿主菌包括大肠杆菌e.coli bl21(de3)。
14、以及，将所述重组表达载体转入宿主细胞进行表达，获得所述hfn。
15、本分明利用分子生物学手段对hfn进行基因表达；通过设定缓冲体系中盐离子浓度及调节ph的变化，介导基因表达后的hfn亚基之间解聚，hfn亚基内表面带有负电荷；通过介导表面带有正电荷的近红外量子点与所述表面带有负电荷的hfn相互吸引，调节缓冲体系ph，介导hfn亚基之间重新组装，使得近红外量子点得以负载于hfn空腔中，从而构建得到以铁蛋白负载近红外量子点的近红外二区发光材料。
16、以及，lfn负载近红外量子点原理为：通过设定缓冲体系盐离子浓度及ph，介导lfn亚基之间解聚，lfn亚基表面带有负电荷；通过介导表面带有正电荷的近红外量子点与所述表面带有负电荷的lfn相互吸引，调节缓冲体系ph，介导lfn亚基之间重新组装，使得近红外量子点得以负载于lfn空腔中，从而构建得到以lfn负载近红外量子点的近红外二区发光材料。
17、具体地，本专利技术实施例中以hfn为例，提供了一种hfn的表达及负载近红外量子点的方法，其包括：
18、(一)、hfn表达菌的构建
19、以hfn的编码基因的核酸序列为基础构建重组质粒，将重组质粒转化入e.colibl21(de3)感受态细胞，在含卡那霉素的lb固体培养基上筛选单克隆阳性菌落，获得hfn表达菌。
20、(二)、hfn的表达与纯化
21、将hfn表达的宿主菌接种于含卡那霉素的lb培养基中，iptg诱导表达后收集菌体，冰浴条件下超声破碎菌体，离心收集上清液，过滤除杂，通过镍柱亲和层析(histrap hp)进行纯化，得到his-hfn，而后通过tev酶切切除his-tag，通过histrap hp预装柱进行纯化，得到hfn。
22、(三)、hfn负载近红外量子点
23、透析状态下，将hfn溶液的ph值调节至2.0，使其解聚为单个亚本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种以铁蛋白为载体的近红外二区发光材料，其特征在于，所述近红外二区发光材料由铁蛋白及装载于铁蛋白内部空腔的近红外量子点构成。
2.根据权利要求1所述的以铁蛋白为载体的近红外二区发光材料，其特征在于，所述铁蛋白为重组人全重链铁蛋白(HFn)或重组人全轻链铁蛋白(LFn)；
3.根据权利要求1所述的以铁蛋白为载体的近红外二区发光材料，其特征在于，所述近红外二区发光材料中的近红外量子点的表面带有正电荷，1个铁蛋白可负载1个近红外量子点；
4.一种编码基因，用于编码如权利要求1-3任一项所述的近红外二区发光材料中的HFn或LFn；所述编码基因的核酸序列如SEQ ID No.2所示，或，如SEQ ID No.4所示。
5.一种重组表达载体，携带有如权利要求4所述的编码基因；优选地，转化/转染所述重组表达载体的宿主菌包括大肠杆菌；更优选地，所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)。
6.根据权利要求1-3任一项所述的铁蛋白为载体的近红外二区发光材料的构建方法，其特征在于，利用分子生物学手段对HFn或LFn进行基因表达；通过设
7.根据权利要求6所述的铁蛋白为载体的近红外二区发光材料的构建方法，其特征在于，具体步骤包括：
8.根据权利要求7所述的铁蛋白为载体的近红外二区发光材料的构建方法，其特征在于，S2中，所述CaCl2法包括将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中进行表达，挑取单克隆菌接种于含有卡那霉素的培养基中，于37℃培养16～20h后，即获得所述HFn或LFn表达菌；
9.根据权利要求8所述的铁蛋白为载体的近红外二区发光材料的构建方法，其特征在于：
10.由权利要求1-3任一项所述的近红外二区发光材料在精子特异性标记及非梗阻性无精症患者睾丸内局部生精灶的标记中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种以铁蛋白为载体的近红外二区发光材料，其特征在于，所述近红外二区发光材料由铁蛋白及装载于铁蛋白内部空腔的近红外量子点构成。
2.根据权利要求1所述的以铁蛋白为载体的近红外二区发光材料，其特征在于，所述铁蛋白为重组人全重链铁蛋白(hfn)或重组人全轻链铁蛋白(lfn)；
3.根据权利要求1所述的以铁蛋白为载体的近红外二区发光材料，其特征在于，所述近红外二区发光材料中的近红外量子点的表面带有正电荷，1个铁蛋白可负载1个近红外量子点；
4.一种编码基因，用于编码如权利要求1-3任一项所述的近红外二区发光材料中的hfn或lfn；所述编码基因的核酸序列如seq id no.2所示，或，如seq id no.4所示。
5.一种重组表达载体，携带有如权利要求4所述的编码基因；优选地，转化/转染所述重组表达载体的宿主菌包括大肠杆菌；更优选地，所述宿主菌为e.coli bl21(de3)。
6.根据权利要求1-3任一项所述的铁蛋白为载体的近红外二区发光材料的构建方法，其特征在于，利用分子生物学手段对hfn...
【专利技术属性】
技术研发人员：王强斌，刘延，李春炎，杜明明，杨红超，鲁明权，
申请(专利权)人：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所，
类型：发明
国别省市：
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