【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一类car-t细胞，尤其涉及一种基于多肽识别的car-t细胞及其构建方法，以及在制备抗肿瘤药物中的应用，属于肿瘤免疫治疗。
技术介绍
1、嵌合抗原受体t(car t)免疫疗法是通过整合嵌合抗原受体的基因修饰的t细胞来抵抗肿瘤细胞的疗法。嵌合抗原受体(car)可以特异性识别肿瘤相关抗原靶点，识别结合后将激活增殖t细胞的信号传递至胞内，引起t细胞激活和增殖，从而有效杀伤肿瘤细胞。因为其强大的抗肿瘤活性，car t在癌症治疗领域应用越来越广。从2017年至今，有6款car t细胞疗法被美国fda批准用于治疗复发难治性b细胞白血病和多发性骨髓瘤。治疗靶点包括cd19和bcma(b细胞成熟抗原)。其中在中国被批准上市两款靶向cd19的car t细胞疗法。
2、car t在血液瘤中疗效显著，但难以攻克实体瘤，主要原因之一是实体瘤无特异性抗原可以作为car t细胞治疗的靶点。人类蛋白质表达图谱(hpa)定义：一种蛋白只有在＜25％的正常组织中表达，才能作为一个有希望的靶点。这种有潜力的靶点仅有7个：cd38、cd20、间皮素、cd22、cd19、cd30和前列腺干细胞抗原(psca)。值得注意的是，像人表皮生长因子受体-2(her2)、前列腺特异性膜抗原(psma)、表皮生长因子受体(egfr)和癌胚抗原(cea)等这些表达量介于中间的靶点。它们在大部分组织中都有中低水平的表达。比如，her2在女性组织、皮肤、肺、泌尿和循环组织中有中低水平的表达。egfr在人肺和皮肤组织有中低水平的表达。当应用这些靶点在治疗肿瘤的时
3、为了解决无特异性抗原引发的非肿瘤靶向毒性，并且降低因为单链抗体过大而对t细胞造成的表达量低的难题，本领域技术人员需要寻找一种分子量较小，且具有较强靶向能力的分子代替单链抗体行使靶向肿瘤细胞的功能。
4、此外，实体瘤在抗原表达上表现出相当大的异质性，以逃避免疫识别。此外，尽管car t细胞对cd19+白血病的完全应答率很高，但已经有不少病例报道描述了抗原丢失和变异现象(antigen loss variants，alvs)。目前正在开发针对多种抗原的策略。其中包括设计具有两个抗原识别域的car；在一个t细胞中表达多个car；或输注多种car t细胞，每种car t表达不同的特异性car。这些方法已经在血液瘤的临床前模型中进行了探索，其中主要是双靶点car t。针对cd19和cd22或cd19和cd20的双靶点car t对于治疗血液系统恶性肿瘤的临床试验正在进行中(nct03448393、nct03241940、nct03019055)。对于实体瘤，临床前研究表明，用双特异性car t细胞靶向her2和il-13rα2可防止alv的发生。
5、有研究报道，t细胞的激活可能需要一些高亲和力或大量低亲和力tcr的累积刺激。chmielewski等之前的研究表明，高亲和力car对不同抗原表达水平的靶细胞有同样的杀伤反应。通过将car t细胞中使用的单链抗体的kd值(降低亲和力)增加2到3log，靶向erbb2和egfr的car t细胞的治疗指数得到了显著改善。此外，pameijer，c.r.j.等人发现，在car t细胞治疗中，单链抗体可以被肽配体取代。由于亲和力低于单链抗体，基于肽的cart细胞只有与高表达taa的肿瘤细胞对接时才会被激活，而不会被正常细胞激活。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于提供一种基于多肽识别的car-t细胞及其构建方法，以克服现有技术中的不足。
2、本专利技术的另一目的还在于提供所述基于多肽识别的car-t细胞的应用。
3、为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：
4、本专利技术实施例提供了一种car多肽，所述car多肽为多肽l1、多肽clt1连接的car多肽，所述多肽l1能够特异性靶向egfr，所述多肽clt1能够特异性识别肿瘤基质中的纤连蛋白。
5、进一步地，所述car多肽为l1-clt1-car t多肽，其具有seq id no.1所示的序列。
6、本专利技术实施例还提供了前述car多肽的构建方法，其包括：使多肽l1、多肽clt1连接于car-t多肽上，获得car多肽。
7、本专利技术实施例还提供了一种编码所述car多肽的核酸。
8、本专利技术实施例还提供了一种表达所述car多肽的基于多肽识别的car-t细胞。
9、本专利技术实施例还提供了一种基于多肽识别的car-t细胞的构建方法，其包括：
10、构建多肽car质粒，其包括多肽l1、多肽clt1连接的car多肽，所述多肽l1能够特异性靶向egfr，所述多肽clt1能够特异性识别肿瘤基质中的纤连蛋白；
11、将所述多肽car质粒基因通过慢病毒载体导入t细胞中，使car多肽基因整合到t细胞基因组上，表达，获得基于多肽识别的car-t细胞。
12、本专利技术实施例还提供了前述的基于多肽识别的car-t细胞在制备具有治疗实体瘤功能的药物中的应用。
13、相应的，本专利技术实施例还提供了一种具有治疗实体瘤功能的药物，其包含前述的基于多肽识别的car-t细胞。
14、与现有技术相比，本专利技术的有益效果至少包括：
15、1)本专利技术提供的靶向egfr和肿瘤基质的双特异性多肽car-t细胞体系利用两条有特异性靶向功能，而且亲和力很高的多肽l1和clt1，联合靶向egfr和肿瘤基质，使car t细胞经过静脉输注到病人体内后，可以更好地穿透将实体瘤包裹严密的肿瘤基质，到达实体瘤内部，解决car t在实体瘤浸润不足的难题，进而更有效地杀伤肿瘤，抑制肿瘤生长；
16、2)本专利技术的靶向egfr和肿瘤基质的双特异性多肽car-t细胞体系由于对肿瘤和肿瘤基质具有良好的靶向杀伤能力，并且可以避免非肿瘤靶向毒性。
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1.一种CAR多肽，其特征在于，所述CAR多肽为多肽L1、多肽CLT1连接的CAR多肽，所述多肽L1能够特异性靶向EGFR，所述多肽CLT1能够特异性识别肿瘤基质中的纤连蛋白。
2.根据权利要求1所述的CAR多肽，其特征在于：所述CAR多肽为L1-CLT1-CAR多肽，其具有SEQ ID No.1所示的序列。
3.根据权利要求1所述的CAR多肽，其特征在于：所述多肽L1具有SEQ ID No.2所示的序列。
4.根据权利要求1所述的CAR多肽，其特征在于：所述多肽CLT1具有SEQ ID No.3所示的序列。
5.如权利要求1-4中任一项所述CAR多肽的构建方法，其特征在于，包括：使多肽L1、多肽CLT1连接于CAR多肽上，获得CAR多肽。
6.一种编码如权利要求1-5中任一项所述的CAR多肽的核酸。
7.一种表达权利要求1-5中任一项所述的CAR多肽的基于多肽识别的CAR-T细胞。
8.一种基于多肽识别的CAR-T细胞的构建方法，其特征在于，包括：
9.权利要求7所述的基于多肽识别的
10.一种具有治疗实体瘤功能的药物，其特征在于包含权利要求7所述的基于多肽识别的CAR-T细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种car多肽，其特征在于，所述car多肽为多肽l1、多肽clt1连接的car多肽，所述多肽l1能够特异性靶向egfr，所述多肽clt1能够特异性识别肿瘤基质中的纤连蛋白。
2.根据权利要求1所述的car多肽，其特征在于：所述car多肽为l1-clt1-car多肽，其具有seq id no.1所示的序列。
3.根据权利要求1所述的car多肽，其特征在于：所述多肽l1具有seq id no.2所示的序列。
4.根据权利要求1所述的car多肽，其特征在于：所述多肽clt1具有seq id no.3所示的序列。
5.如权利要求1-4中任一项所述car多肽的构建方法，其特征在于，包括：使多肽l1、多肽...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱毅敏，刘翠娟，
申请(专利权)人：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所，
类型：发明
国别省市：
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