一种硫酯订书肽及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种硫酯订书肽，其特征在于，肽链上含有式(I)或式(II)所示的片段，所述片段位于肽链的端部或中间段，

【技术实现步骤摘要】
一种硫酯订书肽及其制备方法与应用
本专利技术涉及多肽
，具体涉及一种硫酯订书肽及其制备方法与应用。
技术介绍
α-螺旋结构是自然界中存在的一种重要的蛋白质表位，生物体内许多重要的蛋白-蛋白相互作用以及蛋白的识别都是由α-螺旋结构介导的。α-螺旋构象锁定多肽(一般为通过化学手段锁定α-螺旋构象的多肽)是调控细胞内的PPIs的重要工具分子，发展α-螺旋构象锁定多肽策略不仅能为以PPIs为靶点药物设计提供新的活性分子，还能为某一蛋白的功能和结构研究提供分子探针。一方面，构象锁定多肽能够通过非天然化学键绑定多肽抵御蛋白酶的降解，达到提高体内稳定性的效果。另一方面，多肽药物的一大软肋是很难直接透过细胞膜与胞内靶蛋白发生作用，而构象锁定多肽通过稳定α-螺旋以及引入部分疏水侧链(两大透膜关键因素)来提高多肽自身的透膜能力，从而达到靶向治疗的目的。目前α-螺旋构象锁定多肽的主流方法为侧链引入连接臂合成策略，包括烯烃复分解法、Click法、硫醚法、酰胺键法、光控法等等。然而，产物异构化、水溶性差及依赖固相环合等问题限制了这些策略在实践中的应用，为解决这些问题，我们急需开发更具实用性和普适性的α-螺旋构象锁定策略。许多重要的生物过程的调节都通过蛋白-蛋白相互作用来实现的。一般，蛋白-蛋白作用的界面太大而不能被小分子药物选择性靶向，因此小分子药物很难高效特异性地阻断该类型的相互作用。此外，由于蛋白质药物很难透过细胞膜，它们也不能直接靶向细胞内的相互作用。由于当前药物分子的限制，发展下一代既能进入细胞膜又能特异性靶向蛋白-蛋白相互作用的分子成为新的研究热点。为了克服上述药物分子的缺点，Verdine等发展了一种全碳支架的具有α-螺旋结构的新型多肽，这种多肽被称作订书肽(stapledpeptides)。相比于天然多肽，订书肽有更高的酶解稳定性并且可以进入细胞膜，从而提高了它的药理性能。二硫代氨基甲酸酯类化合物(dithiocarbamates，DTCs)作为一类广泛存在的有机分子，具有多种官能团和杂原子，从而拥有较强的金属键合能力，能够有效地螯合重金属和清除体内NO自由基，还可以作为单功能性诱导物，选择性增强二相酶活性，对生物系统产生深远的影响。因此，不同的DTCs衍生物表现出诸多生物学和药学等方面的特性，有些不仅具有优秀的抗炎抗菌抗氧化抑制心脏过度肥大等活性，最近还被报道为有效的抗癌药物和细胞凋亡的抑制剂。由于DTCs类化合物高效、低毒及易合成等优点使其已成为当前药物化学领域研究的热点，但是DTCs在α-螺旋构象锁定多肽中的应用还未见报道。
技术实现思路
针对现有技术中多肽构象锁定策略中的缺点，本专利技术的目的在于公开一种硫酯订书肽，以及制备硫酯订书肽的方法或者说是一种多肽构象锁定策略。本专利技术的硫酯订书肽，肽链上含有式(I)或式(II)所示的片段，所述片段位于肽链的端部或中间段，式(I)和式(II)中，各y独立地选自20种蛋白质氨基酸中的一种。本专利技术中，式(I)和式(II)分别简化表示为：优选的，本专利技术的硫酯订书肽则可表示为：其中，n、m为整数，各y独立地选自20种蛋白质氨基酸中的一种。较佳的，n为0～20的整数，m为0～20的整数。进一步的，n+m＝3～20。更进一步的，n+m＝3～10。优选的，本专利技术的硫酯订书肽为下列各式中的一种，本专利技术的硫脂订书肽侧链形成二硫代氨基甲酸酯链接臂，可稳定多肽的α-螺旋构象。本专利技术的制备硫酯订书肽的方法包括步骤：(a)以含有赖氨酸且离赖氨酸四位含有丝氨酸或半胱氨酸的直链肽为原料，在2,5-二溴己二酰胺的作用下，直链肽上的半胱氨酸发生消除反应转化为脱氢丙氨酸；(b)经步骤(a)转化后的直链肽在碱的作用下与CS2反应得到α-螺旋构象锁定的硫酯订书肽。较佳的，步骤(a)可具体为：将直链肽溶于缓冲液B中，然后缓慢滴入溶解有1.3～2倍直链肽重量的2,5-二溴己二酰胺的缓冲液A中，室温反应完全后，分离纯化得到转化后的直链肽；其中缓冲液A含有4～8M盐酸胍，100～200mMNa2HPO4，pH＝8.5；缓冲液B含有4～8M盐酸胍，100～200mMNaH2PO4，pH＝2.5；缓冲液A与缓冲液B体积比为10～20：1。较佳的，步骤(b)可具体为：将经步骤(a)转化后的直链肽溶解于甲醇中，加入有机碱Et3N和CS2，室温反应完全后，分离纯化得到α-螺旋构象锁定的硫酯订书肽。本专利技术制备硫酯订书肽的过程(多肽构象锁定策略)如图1所示，其中直链肽可通过多肽固相合成法(SPPS)高产率地得，随后在液相中实现半胱氨酸(Cys)到脱氢丙氨酸(Dha)的高效率转化，最终利用DTC反应实现液相中的环化，高效绿色地获得α-螺旋构象锁定多肽。在研究硫酯订书肽的制备方法(多肽构象锁定策略)的过程中，本专利技术首先选择表1所示的不同长度的多肽序列进行多肽侧链DTC反应的条件摸索，其中G为甘氨酸，X为脱氢丙氨酸(Dha)，Y为赖氨酸(Lys)或鸟氨酸(Orn)。其中，多肽1a用来考察在i，i+4环合策略，1b用以考察i，i+7环合策略。通过对氨基酸的替换和反应条件的优化，最终确立了在多肽侧链进行DTC反应制备i，i+4硫脂订书肽的方法学。表1建立了i，i+4硫脂订书肽的方法学之后，我们尝试将该策略应用到17-28p53(QETFSDLWKLLP)上，利用该序列中本身包含的Lys，我们将距离Lys四位的Ser残基突变为Dha，便于进行液相中的环化。为了考察环合侧链的长度问题，我们以表2所示的多肽进行DTC反应，分别尝试了Lys，Orn，Dap，Dab四个不同长度的带有氨基侧链的氨基酸。表2通过液相中的反应结果分析，只有p53-SP-1成功地进行了基于DTC反应的环化，得到下式所示的α-螺旋构象锁定多肽，相应的MS和HPLC分析验证进一步验证了我们设立的方法学的可行性。分子式：C73H106N16O19S2；相对分子量理论值：1574.7262；测定MS:[M+H]+1575.7306。随后，本专利技术以PMI(TSFAEYWNLLSP)为修饰对象，对除Phe-3，Trp-7，Leu-10三个关键残基之外的9个残基进行i,i+4的基于DTC反应的构象锁定，设计了前述的PS1-1-3到PS5-2-3等多种新型硫脂订书肽。本专利技术的有益效果在于：本专利技术首次将DTC合成反应引入到α-螺旋构象锁定多肽的制备中，通过在肽段侧链形成二硫代氨基甲酸酯链接臂以稳定多肽的α-螺旋构象，达到构象锁定的目的。该多肽构象锁定策略可有效避免产物异构化、水溶性差及依赖固相环合等问题。基于DTC反应的硫脂订书肽首先能够稳定α-螺旋构象，即在与MDM2和MDMX的结合能力上与母肽相比能有明显的提升。其次，该类硫脂订书肽与直链肽相比能够在酶稳定性上得到改善，进而提高MDM2和MDMX的多肽类拮抗剂的生物利用度。最后，该硫脂订书策略的应用能够改善多肽药物的透膜能力，体现在这个案例中即为得到的硫脂订书肽能够透过肿瘤细胞膜，从而靶向作用于MDM2和MDMX，达到抑制肿瘤的作用。附图说明图1为制备硫酯订书肽的过程(多肽构象锁定策略)示意图。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。实施例1硫酯订书肽合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种硫酯订书肽，其特征在于，肽链上含有式(I)或式(II)所示的片段，所述片段位于肽链的端部或中间段，

【技术特征摘要】
1.一种硫酯订书肽，其特征在于，肽链上含有式(I)或式(II)所示的片段，所述片段位于肽链的端部或中间段，式(I)和式(II)中，各y独立地选自20种蛋白质氨基酸中的一种。2.如权利要求1所示的硫酯订书肽，其特征在于，其为：其中，n为0～20的整数，m为0～20的整数，各y独立地选自20种蛋白质氨基酸中的一种。3.如权利要求1所示的硫酯订书肽，其特征在于，n+m＝3～20。4.如权利要求1所示的硫酯订书肽，其特征在于，n+m＝3～10。5.如权利要求1所示的硫酯订书肽，其特征在于，其为下列各式中的一种：6.一种制备硫酯订书肽的方法，其特征在于，包括步骤：(a)以含有赖氨酸且离赖氨酸四位含有丝氨酸或半胱氨酸的直链肽为原料，在2,5-二溴己二酰胺的作用下，直链肽上的半胱氨酸发生消除反应转化为脱氢丙氨酸；(b)经步骤(a)转化后的直链肽在碱...

【专利技术属性】
技术研发人员：李翔，邹燕，胡宏岗，陆五元，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海,31