非膜破坏性p53活化装订肽制造技术

本发明专利技术涉及非膜破坏性的p53活化装订肽以及涉及使用这些肽的癌症治疗方法。在一个实施方案中，所述肽包含TSFXaa1EYWXaa3LLXaa2的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa1是(R)‑2‑(7′‑辛烯基)丙氨酸或其衍生物，或者是(R)‑2‑(4′‑戊烯基)丙氨酸或其衍生物；以及Xaa2和Xaa3独立地是任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸。在另一个实施方案中，所述肽包含TSFXaa1EYWXaa3LLXaa2ENXaa5的氨基酸序列或由其组成，其中Xaa1和Xaa3是任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸；Xaa2是S或P或(S)‑2‑(4′‑戊烯基)丙氨酸或(S)‑2‑(4′‑戊烯基)丙氨酸的衍生物，以及其中Xaa5是F或Y。

Non membrane destructive p53 active binding peptide

The present invention relates to a non - membranous destructive p53 binding peptide and a cancer therapy for the use of these peptides. In one embodiment, the peptide amino acid sequence of TSFXaa1EYWXaa3LLXaa2 contains or consists of, which is Xaa1 (R) 2 (7 'octylene) alanine or its derivatives, or (R) 2 (4' pentenyl) alanine or its derivatives; and Xaa2 and Xaa3 are independently of any type of amino acid or amino acid modified. In another embodiment, the peptide containing the amino acid sequence of TSFXaa1EYWXaa3LLXaa2ENXaa5 or consisting of Xaa1 and Xaa3, which is of any type of amino acid or amino acid modified; Xaa2 is S or P or (S) 2 (4 'pentenyl) or alanine (S) (2 4' pentenyl) alanine derivatives, wherein Xaa5 is F or Y.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】非膜破坏性p53活化装订肽相关申请的交叉引用本申请要求于2015年2月13日提交的新加坡临时申请No.10201501119W的优先权权益，其内容出于所有目的而在此通过引用整体并入。
本专利技术一般性地涉及蛋白质化学领域。特别地，本专利技术涉及装订肽的应用。
技术介绍
p53:Mdm2相互作用的抑制是一个治疗靶标。能够阻断所述相互作用的分子可以通过阻断Mdm2的两种抑制活性来激活p53应答，所述两种抑制活性即其封闭N-末端p53反式激活结构域和其靶向p53进行泛素化和蛋白酶体降解。这样的分子可用于重新激活p53野生型肿瘤细胞中的p53功能。已经开发了抑制p53与Mdm2之间的这种相互作用的几类分子(例如Nutlin、MI-219)。这些分子模拟来自p53N-末端中序列部分的与Mdm2的N-末端p53结合结构域相互作用所必需的保守残基。然而，这些肽对无p53细胞显示出脱靶毒性，并且在血清存在下不具有功能。因此，需要提供能够抑制p53:Mdm2相互作用的经改进肽。专利技术概述在一个方面，本专利技术涉及包含TSFXaa1EYWXaa3LLXaa2的氨基酸序列或由其组成的肽，其中Xaa1是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸或其衍生物，或者是(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或其衍生物；以及Xaa2和Xaa3独立地是任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸。在另一方面，本专利技术涉及包含TSFXaa1EYWXaa3LLXaa2ENXaa5的氨基酸序列或由其组成的肽，其中Xaa1和Xaa3是任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸；Xaa2是S或P或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物；以及其中Xaa5是F或Y。在另一方面，本专利技术涉及包含TSFXaa1EYWXaa3LLXaa2的氨基酸序列或由其组成的肽，其中Xaa1、Xaa2和Xaa3独立地选自任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸；以及其中肽的N-末端(即T)与接头结合，产生不扰乱细胞膜完整性的分子。在另一方面，本专利技术涉及一种分离的核酸分子，其编码根据前述权利要求中任一项所述的肽。在另一方面，本专利技术涉及一种载体，其包含如本文所述的分离的核酸分子。在另一方面，本专利技术涉及一种宿主细胞，其包含如本文所述的核酸分子或如本文所述的载体。在另一方面，本专利技术涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的肽、如本文所述的分离的核酸分子或如本文所述的载体。在一个方面，本专利技术涉及如本文所述的肽在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。在另一方面，本专利技术涉及在患者中治疗或预防癌症的方法，其包括施用药物有效量的如本文所述的肽或如本文所述的分离的核酸分子或如本文所述的载体。附图简述当结合非限制性实例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本专利技术，在附图中：图1是显示在Mdm2表面上鉴定到的辅助结合位点(圆圈)的图像。来自apoMdm2的配体映射模拟的苯占据图(网格)覆盖在其与a)p53肽(PDB1YCR)和b)nutlin-2(PDB1RV1)的复合物的晶体结构上。图2示出了描绘延伸的装订肽的设计的图像。a)示出了附加至p53肽(PDB1YCR)的C-末端的苯基(Phe)残基，使得其与结合在第二nutlin相互作用位点中的苯重叠。b)示出了苯基(Phe)残基附加到SAH-p53-8(PDB3V3B)的C-末端，使得其与结合在近端Pro27位点中的苯重叠。c)示出了在50纳秒分子动力学(MD)模拟后YS-01的构象。d)示出了在50纳秒分子动力学(MD)模拟后YS-03的构象。图3示出了在A)不存在10％胎牛血清(FCS)下和B)存在10％胎牛血清(FCS)下进行的YS-01至-04装订肽的鼠T22p53报道子筛选结果。在不存在血清下(C，E)或存在血清下(D，F)用50μM、25μM或12.5μM肽处理T22细胞或ARN8细胞，并在2小时后确定释放到细胞培养基中的细胞溶质乳酸脱氢酶(LDH)的水平。乳酸脱氢酶(LDH)释放到培养基中指示该肽对细胞膜的不利的去稳定作用。图4在(A)中示出了T22细胞的western印迹分析的结果，所述T22细胞已经在存在胎牛血清下(+)或不存在胎牛血清下(-)用25μM和50μM的YS-03处理18小时的时间。(B)用于确定在不存在胎牛血清下和存在胎牛血清下YS-03和YS-04的IC50值的滴定曲线。图5示出了与YS-01和YS-02结合的Mdm2的晶体结构的图像。(a)示出了与YS-01结合的Mdm2；(b)示出了与YS-02结合的Mdm2。(c)示出了YS-02的Tyr30与Mdm2的近端Pro27位点的结合，其中氢键以虚线表示。图6示出了将YS-02与其他肽进行比较的棒状图。YS-02与(A)野生型(WT)p53(PDB1YCR)以及(B)M06(PDB4UMN)和SAH-p53-8(PDB3V3B)的比较。图7示出了描绘在A)存在10％胎牛血清(FCS)下和B)不存在10％胎牛血清(FCS)下进行并与YS-01和02类似物肽比较的YS-07、YS-08、YS-09和YS-10装订肽的鼠T22p53报道子筛选的数据的图。在不存在血清下(C)用50μM、25μM或12.5μM肽处理T22细胞，并在2小时后，确定释放到细胞培养基中的细胞溶质乳酸脱氢酶(LDH)的水平。还在不存在血清下(D)用50μM、25μM或12.5μM的肽处理人ARN8细胞，并还在2小时后确定其释放到细胞培养基中的细胞溶质乳酸脱氢酶(LDH)的水平。用于确定T22p53报道子细胞系中在不存在胎牛血清下和存在胎牛血清下YS-07至YS-10的IC50值的滴定曲线(线图E和F)。图8示出了描绘在无血清条件下针对ARN8细胞滴定并确定其相应的p53活性和乳酸脱氢酶(LDH)释放水平的YS-07(A)和YS-09(B)的图。所得曲线重叠(浅色曲线表示p53活性，深色曲线表示乳酸脱氢酶释放)。在不存在血清下(C)或存在血清下(D)用50μM、25μM或12.5μM的YS-07、sMTIDE-02和Nutlin处理T22和ARN8细胞，并在2小时后确定其释放到细胞培养基中的细胞溶质乳酸脱氢酶的水平。确定YS-07在不同血清条件下在T22和ARN8报道子细胞系中激活p53的活性，并与Nutlin和sMTIDE-02进行比较：(E)在无血清条件下的T22细胞，(F)具有10％血清的T22细胞，(G)在无血清条件下的ARN8细胞，以及(H)具有10％血清的ARN8细胞。细胞处理18小时。图9示出了在50纳秒分子动力学(MD)模拟期间与a)YS-01、b)YS-02、c)YS-03和d)YS-04的MDM2复合物的原子位置的Cα均方根偏差(RMSD)的数据。对每种复合物使用两种不同的初始结构。图10示出了YS-01至06变体肽的圆二色谱。图11示出了装订肽的2Fo-Fc电子密度图。示出了(A)YS-01和(B)YS-02的图，并且其以1.3σ为等高线。蛋白质A和肽F均显示在两个图中。在两种装订肽上都观察到良好密度，除Glu28和Asn29的侧链之外，其显示出有限的密度。图12示出了Mdm2/YS-01结构的不对称单元的带状图像，突出了链A和B之间的链交换。由于晶体接触，这种交换不会发生在链C和D中。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的肽：TSFXaa1EYWXaa3LLXaa2其中Xaa1是(R)‑2‑(7'‑辛烯基)丙氨酸或其衍生物，或者是(R)‑2‑(4'‑戊烯基)丙氨酸或其衍生物；以及Xaa2和Xaa3独立地是任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.13 SG 10201501119W1.一种包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的肽：TSFXaa1EYWXaa3LLXaa2其中Xaa1是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸或其衍生物，或者是(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或其衍生物；以及Xaa2和Xaa3独立地是任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸。2.根据权利要求1所述的肽，其中Xaa3是A或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物。3.根据权利要求1所述的肽，其中Xaa2是S或P或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物。4.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽是具有使第一氨基酸Xaa1与第二氨基酸Xaa2连接的交联接头的交联肽；或者其中所述肽是具有使第一氨基酸Xaa1与第二氨基酸Xaa3连接的交联接头的交联肽。5.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中所述肽进一步包含含有与其C-末端结合的氨基酸-ENXaa5的序列，产生：TSFXaa1EYWXaa3LLXaa2ENXaa5其中Xaa5是F或Y。6.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽的N-末端或C-末端与接头结合，产生不扰乱细胞膜完整性的分子。7.根据权利要求6所述的肽，其中所述接头是共价接头。8.根据权利要求7所述的肽，其中所述接头的长度为1至20个氨基酸。9.根据权利要求7所述的肽，其中所述共价接头选自由烃接头或疏水性烃接头组成的组。10.根据权利要求9所述的肽，其中所述烃接头包含Ahx(氨基己酸)。11.根据权利要求6至10中任一项所述的肽，其中序列Zn与如权利要求6至7中限定的接头的未结合端连接，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，以及其中Z是具有单个局部正电荷的分子。12.根据权利要求11所述的肽，其中Zn是1或2或3。13.根据权利要求11或12所述的肽，其中Z选自由丁胺、精氨酸[R]或赖氨酸[K]所组成的组。14.根据权利要求6至13中所述的肽，其中所述接头和权利要求11至13中所述的序列Z包含序列Ac-KK-Ahx(乙酰化-Lys-Lys-氨基己酸)或Ac-RRR-Ahx(乙酰化-Arg-Arg-Arg-氨基己酸)。15.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中所述肽包含选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10组成的组的序列。16.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中不含所述接头的肽的长度为4至15个氨基酸。17.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中所述肽已经历选自由添加一个或更多个磷酰基所组成的组的翻译后修饰。18.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中所述肽被修饰以包含选自由以下组成的组的一种或更多种配体：羟基、磷酸酯、胺、酰胺、硫酸酯、硫化物、生物素部分、碳水化合物部分、脂肪酸衍生酸基团、荧光部分、生色团部分、放射性同位素、PEG接头、亲和标记、靶向部分、抗体、细胞穿透性肽以及上述配体的组合。19.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中通过添加独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组的一个或更多个卤素来修饰所述肽的第7位的W。20.根据权利要求19所述的肽，其中所述肽包含1、2、3、4或5个卤素。21.根据权利要求19所述的肽，其中通过在W的C6位添加卤素来修饰第7位的W和/或其中W独立地是L或D光学异构体。22.根据权利要求20至21中任一项所述的肽，其中所述卤素为Cl。23.根据权利要求4所述的肽，其中所述肽包含下式：或者根据权利要求4所述的肽，其中所述肽包含下式：其中：R1是-C(OH)CH3[T]；R2是-CH2OH[S]；R3是苄基[F]；R4和R11独立地为H，或C1至C10烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；R5是-(CH2)2C(O)OH[E]；R6是-CH2-苯基-OH[Y]；R7是Trp的侧链，其中Trp的C6被氢或卤素取代，和/或其中Trp独立地是L或D光学异构体；R8是任意氨基酸的侧链；R9和R10是-CH2CH(CH3)2[L]；R是烷基、烯基、炔基；[R’–B–R”]n；其各自被0至6个R12取代；R’和R”独立地是亚烷基、亚烯基或亚炔基；每个R12独立地为卤代、烷基、OR13、N(R13)2、SR13、SOR13、SO2R13、CO2R13、R13、荧光部分或放射性同位素；B独立地为O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR13，或者；每个R13独立地为H、烷基或治疗剂；n是1至4的整数。24.根据权利要求23所述的肽，其中R4和R11独立地为H或C1-C6烷基。25.根据权利要求23所述的肽，其中R选自由C8烷基、C11烷基、烯基、C8烯基、C11烯基、直链烷基、烯基和炔基组成的组。26.根据权利要求23所述的肽，其中R1、R2、R3、R5、R6、R7、R8、R9、R10如权利要求13中定义；其中R4和R11是H；以及其中R是C11烯基。27.一种肽，其包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：TSFXaa1EYWXaa3LLXaa2ENXaa5其中Xaa1和Xaa3是任何类型的氨基酸或经修饰氨基酸；Xaa2是S或P或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(S)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物；以及其中Xaa5是F或Y。28.根据权利要求27所述的肽，其中Xaa3是N或A或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物；以及其中如果Xaa3是N，则Xaa1不是A和/或Xaa2不是S。29.根据权利要求27所述的肽，其中Xaa1是(R)-2-(7'-辛烯基)丙氨酸或其衍生物，或者是(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或其衍生物。30.根据权利要求28所述的肽，其中Xaa3是A或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸或(R)-2-(4'-戊烯基)丙氨酸的衍生物。31.根据权利要求27所述的肽，其中所述肽是具有使第一氨基酸Xaa1与第二氨基酸Xaa2连接的交联接头的交联肽；或者其中所述肽是具有使第一氨基酸Xaa1与第二氨基酸Xaa3连接的交联接头的交联肽。32.根据权利要求27所述的肽，其中所述肽的N-末端或C-末端与接头结合，产生不扰乱细胞膜完整性的分子。33.根据权利要求32所述的肽，其中所述接头是共价接头。34.根据权利要求32至33中所述的肽，其中所述接头的长度为1至20个氨基酸。35.根据权利要求33所述的肽，其中所述共价接头选自由烃接头或疏水性烃接头组成的组。36.根据权利要求35所述的肽，其中所述烃接头包含Ahx(氨基己酸)。37.根据权利要求32至36中所述的肽，其中序列Zn与如权利要求32至36中限定的接头的未结合端连接，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，以及其中Z是具有单个局部正电荷的分子。38.根据权利要求37所述的肽，其中Zn是1或2或3。39.根据权利要求37或38所述的肽，其中Z选自由丁胺、精氨酸[R]或赖氨酸[K]组成的组。40.根据权利要求32至39中所述的肽，其中所述接头和权利要求82至87中所述的序列Z包含序列Ac-KK-Ahx(乙酰化-Lys-Lys-氨基己酸)或Ac-RRR-Ahx(乙酰化-Arg-Arg-Arg-氨基己酸)。41.根据权利要求27至40中任一项所述的肽，其中所述肽包含选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10组成的组的序列。42.根据权利要求27至41中任一项所述的肽，其中不含所述接头的肽的长度为4至15个氨基酸。43.根据权利要求27至42中任一项所述的肽，其中所述肽已经历选自由添加一个或更多个磷酰基所组成的组的翻译后修饰。44.根据权利要求27至43中任一项所述的肽，其中所述肽被修饰以包含选自由以下组成的组的一种或更多种配体：羟基、磷酸酯、胺、酰胺、硫酸酯、硫化物、生物素部分、碳水化合物部分、脂肪酸衍生酸基团、荧光部分、生色团部分、放射性同位素、PEG接头、亲和标记、靶向部分、抗体、细胞穿透性肽以及上述配体的组合。45.根据权利要求27至44中任一项所述的肽，其中通过添加独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组的一个或更多个卤素来修饰所述肽的第7位的W。46.根据权利要求45所述的肽，其中所述肽包含1、2、3、4或5个卤素。47.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈耀宸，克里斯托弗·约翰·布朗，钱德拉·S·韦尔马，F·J·费雷尔加戈，大卫·P·雷恩，T·约瑟夫，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡,SG