新型荧光报道分子及其应用,包括对胱天肽酶的测定制造技术

本发明专利技术涉及新型荧光染料、新型发荧光及荧光报道分子和新的测定法，这些测定法能用来检测来源于任何活生物或器官的全细胞、细胞系和组织标本中胱天肽酶的活性及参与细胞凋亡的其它酶的活性。这些报道分子及测定法能用于药物筛选方法，用来鉴定在全细胞或组织中作为胱天肽酶级联抑制剂或诱导剂的化合物。此处所述的试剂和测定也能用于确定人癌细胞对化疗药治疗的化学敏感性。本发明专利技术也涉及新型发荧光或荧光报道分子及新的酶测定法，它们能用来检测２型甲硫氨酸氨肽酶、二肽基肽酶ＩＶ、钙激活蛋白酶、氨肽酶、ＨＩＶ蛋白酶、腺病毒蛋白酶、ＨＳＶ－１蛋白酶、ＨＣＭＶ蛋白酶和ＨＣＶ蛋白酶的活性。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,包括对胱天肽酶的测定的制作方法
技术介绍
描述专利
本专利技术属于应用发荧光或荧光探针对酶的细胞内检测的领域之中。本专利技术涉及新型荧光染料，以及这些染料在制备作为蛋白酶及肽酶底物的新型发荧光或荧光肽或氨基酸衍生物方面的用途。本专利技术尤其涉及新型发荧光或荧光肽衍生物，它们是与细胞凋亡有关的酶如胱天肽酶(caspase)和淋巴细胞衍生的丝氨酸蛋白酶粒酶B的底物。本专利技术也涉及测定胱天肽酶和其它酶活性的方法，这些酶在来源于任何健康、病患、感染或癌器官或组织的活或死的全细胞、细胞系或组织样品中参与细胞凋亡。本专利技术也涉及发荧光或荧光底物在新型测定系统中用于在化合物集合或化合物文库中发现或检测细胞凋亡抑制剂或诱导剂的应用。此外，本专利技术涉及发荧光或荧光底物在测定癌细胞对化疗药治疗敏感性方面的应用。本专利技术也涉及新型发荧光或荧光肽衍生物，它们是外肽酶(如氨肽酶A和N、甲硫氨酸氨肽酶和二肽基肽酶IV)、内肤酶(如钙激活蛋白酶)、蛋白酶(如HIV蛋白酶、HCMV蛋白酶、HSV蛋白酶、HCV蛋白酶和腺病毒蛋白酶)的底物。相关技术生物通过一种被不同地称为调控性细胞死亡、程序性细胞死亡或细胞凋亡的方法来消除不需要的细胞。这种细胞死亡作为动物发育的正常方面，并在组织内环境稳定和老化中发生(Glucksmann，A.，剑桥哲学学会生物学综述(Biol.Rev.Cambridge Philos.Soc.)26:59-86(1951)；Glucksmann，A.，生物学文献(Archives de Biologie)76:419-437(1965)；Ellis等人，发育(Dev.)112:591-603(1991)；Vaux等人，细胞(Cell)76:777-779(1994))。细胞凋亡调节细胞数量、利于形态发生、去除有害的或其它异常的细胞，并消除已经行使其功能的细胞。另外，细胞凋亡可随多种生理应激反应如低氧或局部缺血而发生(PCT公布申请WO96/20721)。经历调节细胞死亡的细胞具有多种形态学改变，包括质膜与核膜起泡、细胞皱缩(核质和细胞质的凝聚)、细胞器再定位和压缩、染色质凝聚以及凋亡体(包含胞内物质的膜包围的颗粒)的产生(Orrenius，S.等人，内科学杂志(J.Internal Medicine)237:529-536(1995))。细胞凋亡是通过一种细胞自杀的内源机制实现的(Wyllie，A．H.，于《生物学与病理学中的细胞死亡》(Cell Death In Biology andPathology)，Bowen和Lockshin编，Chapman and Hall(1981)，9-34页)。由于内部或外部信号细胞激活其内部编码的自杀程序。该自杀程序是通过精细调节的遗传程序的激活而实现的(Wylie等人，国际细胞学综述(Int.Rev.Cyt.)68:251(1980)；Ellis等人，细胞生物学年述(Ann.Rev.Cell Bio.)7:663(1991))。凋亡细胞和凋亡体通常在裂解前被邻居细胞或巨噬细胞识别并清除。由于这种清除机制，尽管大量细胞被清除但不诱发炎症(Orrenius，S.，内科学杂志237:529-536(1995))。哺乳动物白细胞介素-1β(IL-1β)在许多病理过程中起重要作用，包括慢性及急性炎症和自身免疫病(Oppenheim，J.H.等人，今日免疫学(Immunology Today)，7,45-56(1986)。IL-1β是作为一种细胞结合的前体多肽(前IL-1β)而合成的，它不能结合IL-1受体，并且无生物学活性(Mosley等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)262:2941-2944(1987))。通过抑制前体IL-1β向成熟IL-1β的转化，白细胞介素-1的活性可受到抑制。IL-1也是一种参与介导多种生物学反应的细胞因子，包括炎症、脓毒性休克、创伤愈合、血细胞生成和某些白血病的发展(Dinarello，C.A.血液(Blood)77:1627-1652(1991)；diGiovine等人，今日免疫学11:13(1990))。白细胞介素-1β转化酶(ICE)是一种负责白细胞介素-1β(IL-1β)激活的蛋白酶(Thornberry，N．A.等人，自然(Nature)356:768(1992)；Yuan，J.等人，细胞75:641(1993))。ICE是一种底物特异性半胱氨酸蛋白酶，它切割无活性的前白细胞介素-1，产生成熟的IL-1。编码ICE和CPP32的基因是哺乳动物ICE/Ced-3基因家族的成员，该家族目前至少包括12个成员ICE、CPP32/Yama/Apopain、mICE2、ICE4、ICH1、TX/ICH-2、MCH2、MCH3、MCH4、FLICE/MACH/MCH5、ICE-LAP6和ICEre1Ⅲ。该半胱氨酸蛋白酶家族的蛋白水解活性在介导细胞死亡中似乎是关键的，其活性位点半胱氨酸残基对于ICE介导的细胞凋亡是必不可少的(Miura等人，细胞75:653-660(1993))。该基因家族最近被命名为胱天肽酶(Alnernri，E.S.等人，细胞87:171(1996))。死亡触发物，如肿瘤坏死因子、FAS-配体、氧或养分丧失、病毒、毒素、抗癌药等等，能以类似于级联(cascade)的方式激活细胞内的胱天肽酶，其中级联上游的胱天肽酶(例如FLICE/MACH/MCH5)能激活级联下游的胱天肽酶(例如CPP-32/Yama/Apopain)。胱天肽酶级联的激活导致细胞死亡。大量科学证据表明，在多种疾病中，当不应激活时胱天肽酶级联得到激活。这导致过度的细胞自杀和器官衰竭。与胱天肽酶级联的不适当激活及随后细胞自杀有关的疾病包括心肌梗死、充血性心力衰竭、自身免疫病、AIDS、病毒感染、肾衰竭、肝衰竭、风温性关节炎、局部缺血性中风、神经变性疾病、动脉粥样硬化等。因此，能阻断或抑制胱天肽酶级联激活的新药物的发现对大多数-如果不是全部的话-人体器官系统的退行性疾病的治疗将有广泛影响。也认为胱天肽酶在癌症的发展和治疗中是重要的。有可靠的证据表明，当含有胱天肽酶时，癌细胞缺少能激活胱天肽酶级联的部分分子机器(Los等人，血液，90卷，8号3118-3129(1997))。这使癌细胞丧失了经历细胞自杀的能力，于是细胞成为无限增殖的一它们成为癌细胞。已经显示，化疗(抗癌)药物能通过再激活休眠的胱天肽酶级联而触发癌细胞经历自杀。这可能是大多数-如果不是全部的话-已知抗癌药的作用方式的重要方面(Los等人，血液，90卷，8号3118-3129(1997)；Friesen等人，自然杂志医学分册(Nat.Med.)2:574(1996))。化疗药可能在激活不同类型癌症胱天肽酶系统的能力上有所不同。此外，抗癌药也可能在激活特定癌症(例如肺癌)及不同患者中胱天肽酶级联的能力上有所不同。换句话说，在如肺癌细胞对不同抗癌药的化学敏感性方面，患者与患者之间存在差异。总之，胱天肽酶级联的过度激活在多种退行性器官疾病中起重要作用，而无功能性胱天肽酶系统是癌细胞的标志。抑制或刺激胱天肽酶级联的新药物可能使许多人类疾病的治疗发生巨大变化，包括传染病、心血管病、内分泌病、肾病、肝病和脑病与免疫系本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有通式Ⅱ的报道化合物：Ｒ↓［１］－（ＡＡ）↓［ｎ］－Ａｓｐ－ｙ－Ａｓｐ－（ＡＡ）↓［ｎ］－Ｒ↓［１］ （Ⅱ）或其生物学可接受的盐或其前报道分子，其中Ｒ↓［１］是Ｎ端保护基团；每个ＡＡ独立地为α－氨基酸或β－氨基酸残基， 或α－氨基酸或β－氨基酸的衍生物；每个ｎ独立地为０－５；并且ｙ是发荧光或荧光部分。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：E威伯，蔡遂雄，JFW克阿纳，JA德里威，张汉忠，
申请(专利权)人：西托维亚公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]