生产氨肽酶的方法技术

公开了一种有效生产氨肽酶的方法。该方法包括以下步骤：或用一种氨肽酶基因和一种中性蛋白酶基因转化入宿主细菌，或用氨肽酶基因转化一部分宿主细菌，而用中性蛋白酶基因转化另一部分宿主细菌；在培养基中培养用氨肽酶基因和中性蛋白酶基因转化了的宿主细菌或用氨肽酶基因转化的宿主细菌和用中性蛋白酶基因转化的宿主细菌的混合物，以表达氨肽酶和中性蛋白酶基因，回收由培养混合物中产生的氨肽酶。

Process for producing aminopeptidase

A process for the efficient production of aminopeptidase is disclosed. The method comprises the following steps: or a aminopeptidase gene and a neutral protease gene was transformed into host bacteria, or by aminopeptidase gene into a part of the host bacterium with neutral protease gene into another part of the host bacterium; in cultured mixture of bacteria or bacterial host host gene transformation by aminopeptidase the enzyme and by neutral protease gene into host bacteria with aminopeptidase gene and neutral protease gene into the medium, the expression of aminopeptidase and neutral protease gene, recovered by cultivation of aminopeptidase produced in the mixture.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种，尤其涉及利用大肠杆菌生产氨肽酶的改进方 法。
技术介绍
自从20世纪80年代重组DNA技术建立以来，利用大肠杆菌广泛生产了真核简单 蛋白，其提供了低成本的生产。在自然发生的生物体中，许多蛋白质首先被合成为非活性前 体蛋白的形式，随后经蛋白水解酶切割(如，除去氨基末端(N-末端)的甲硫氨酸)或其它 处理，以形成成熟蛋白质。但是，由原核大肠杆菌生产的真核蛋白质经常具有一个或更多非 必需氨基酸残基，例如甲硫氨酸，其来源于启始密码子并保留在其N-末端。具有此类一个 或更多非必需氨基酸残基的蛋白质若作为药物施用于人，则可引起诸如过敏反应的抗原抗 体反应。因此，此类非必需氨基酸残基应被除去。在具有从蛋白的氨基末端(N-末端)开始一个一个地切割氨基酸残基的活性的氨 肽酶中，已知多种各有不同的种类，例如特异性不同。因此，已报道利用氨肽酶将前体蛋白 转化为其相应的成熟蛋白的方法(例如专利文献1，专利文献2和专利文献3).例如，当使用重组大肠杆菌生产人生长激素时，其以一种前体人生长激素的形式 获得，该形式的N-末端保留有一个甲硫氨酸残基，并因此其氨基酸序列N-末端以诸如Met-Phe-Pro......”等的形式开始。在氨肽酶中，那些具有其切割肽键的反应在蛋白质的脯氨酸前的一个残基停止的性质的氨肽酶能选择性单独除去人生长激素前体N-末端的甲 硫氨酸。众所周知，人成熟生长激素可使用此类氨肽酶从前体人生长激素获得，通过这样的 方法生产的含有人成熟生长激素的药物制剂目前也供应于制药市场。迄今已知道不同种类的氨肽酶，它们适用于除去正如包含在人前体生长激素中 的N-末端甲硫氨酸(专利文献4，专利文献5)。一种此类氨肽酶是溶蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)的氨肽酶。该酶的生产是通过以由4个结构域(信号肽、N-末端前肽、成 熟域和C-末端前肽)组成的前蛋白原(pr印roprotein)的形式翻译实现。溶蛋白弧菌的 氨肽酶具有以下益处其发现于溶蛋白弧菌已培养了特定时间长度的培养基中，且其随后 可容易的从细胞中分离，例如通过离心。但是，它有一个很大的缺陷即，由于发现于这种培 养基中的氨肽酶量少，生产工业需求的氨肽酶需要大型设备，且证实是昂贵的。因此，已进 行研究以修饰溶蛋白弧菌氨肽酶基因使之适应在大肠杆菌中表达，通过例如用PelB取代 其分泌信号，并因此通过大肠杆菌生产和分泌氨肽酶。但是，这种方法的生产效率至多是使 用溶蛋白弧菌自身的情况的约三倍。总的来说，氨肽酶(AP) —旦以非活性形式翻译产生后，即被转化为活性形式，其 机制尚未完全清楚。已知在一些与溶蛋白弧菌相近的种中，AP通过某种蛋白酶的切割转化 为活性形式(非专利文献1，非专利文献2)。此外，在溶蛋白弧菌的培养物中发现了一种中 性蛋白酶[vibriolysin :nprV](非专利文献3，非专利文献4，非专利文献5)。弧菌溶血素 (Vibriolysin)是一种胞外锌金属蛋白酶，其通过以一种肽链的形式翻译而产生，该肽链的组成是由氨基酸1-24组成的信号肽，由氨基酸25-196组成的N-末端肽和剩下的形成成熟蛋白质的氨基酸197-609。尚未清楚弧菌溶血素在由溶蛋白弧菌生产氨肽酶中的作用。[专利文献1]日本专利申请公开号.H62-244381[专利文献2]日本专利申请 公开号.H62-500003 [专利文献3]日本专利申请公开号.2004-533263 [专利文献4] W086/01229[专利文献5]美国专利号5569598[非专利文献1]S. Nirasawa等，(1999) Biochim Biophys Acta. Augl7 ；1433 (1-2) 335-42 [非专利文献 2] ΖΖ· Zhang 等，(2000) Biochem J. Sep 15 ；350Pt 3:671-6 [非专利文献 3] J. Prescott 等，(1976)Methods Enzymol. 45404-415 [非专利文献4] D. Durham (1990) Appl Environ Microbiol. Aug ；56 (8) 2277-81 [非专利文献5]S. Shinoda等，(2004)Handbook of Proteolytic Enzymes，第二版， 399-40
技术实现思路
与上述背景相对，本专利技术的目的是提供一种以提高的效率。[解 决问题的方法]通过使溶蛋白弧菌氨肽酶基因和一种在相同细菌中产生的中性蛋白酶——弧菌 溶血素(nprV)基因在大肠杆菌中共表达，本专利技术的专利技术人成功在培养上清中获得了氨肽 酶，其效率比使用大肠杆菌细胞转化体可能获得的效率更高。进一步的，通过修饰nprV基 因的核苷酸序列，本专利技术的专利技术人成功使这种转化体大肠杆菌细胞以惊人的高效率稳定生 产氨肽酶并分泌到胞外。本专利技术基于这些发现而完成。本专利技术提供一下1. 一种，包含以下步骤或者用氨肽酶基因 和用中性蛋白酶基因转化宿主细菌，或者用氨肽酶基因转化一部分宿主细菌而用中性蛋白 酶基因转化另一部分宿主细菌，在培养基中培养用氨肽酶基因和用中性蛋白酶基因转化了 的宿主细菌，或培养用氨肽酶基因转化的宿主细菌和用中性蛋白酶基因转化的宿主细菌的 混合物，使氨肽酶基因和中性蛋白酶基因都得到表达，和收集培养混合物中产生的氨肽酶。 2.根据上述1的生产方法，其中收集氨肽酶的步骤包括收集释放到培养上清液中的氨肽 酶。3.根据上述1或2的生产方法，其中氨肽酶基因和中性蛋白酶基因各自是来源于属于 与宿主细菌所属种不同种的细菌的基因。4.根据上述1到3任一所述的生产方法，其中氨 肽酶基因和中性蛋白酶基因都来源于属于一个和相同种的细菌。5.根据上述1到4任一所 述的生产方法，其中氨肽酶基因是这样一种基因，其编码的氨肽酶的特征是其导致的肽键 切割反应在脯氨酸残基前的一个残基终止。6.根据上述1到5任一所述的生产方法，其中 氨肽酶基因和中性蛋白酶基因都来源于溶蛋白弧菌。7.根据上述1到6任一所述的生产方 法，其中宿主细菌是大肠杆菌。8.根据上述1到7任一所述的生产方法，其中当氨肽酶以其 前蛋白原形式存在时，具有如SEQ ID NO :4定义的氨基酸序列。9.根据上述1到8任一所 述的生产方法，其中中性蛋白酶是弧菌溶血素。10.根据上述1到9任一所述的生产方法， 其中以其成熟蛋白形式存在的弧菌溶血素具有如SEQ ID NO :18定义的氨基酸序列。11.根 据上述1到9任一所述的生产方法，弧菌溶血素基因在其N-末端肽区域携带突变。12.根 据上述1到11任一所述的生产方法，其中该变异是发生在N-末端肽区域中第158位氨基酸残基的Ala到Val的突变。13. —种作为编码弧菌溶血素前肽的核苷酸的弧菌溶血素基 因，包括如SEQ ID NO: 15定义的核苷酸序列。14.根据上述13的弧菌溶血素基因，该基因 包含如SEQ ID NO :15定义的核苷酸序列和跟随此核苷酸序列的如SEQ ID N0:17定义的 核苷酸序列。15.根据上述14的弧菌溶血素基因，包含编码信号序列的核苷酸序列，跟随 信号序列的如SEQ ID NO :15定义的核苷酸序列，和跟随SEQ IDNO 15定义的核苷酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产氨肽酶的方法，包含以下步骤：用氨肽酶基因和用中性蛋白酶基因转化宿主细菌，或者用氨肽酶基因转化一部分宿主细菌而用中性蛋白酶基因转化另一部分宿主细菌，在培养基中培养用氨肽酶基因和用中性蛋白酶基因转化了的宿主细菌，或培养用氨肽酶基因转化的宿主细菌和用中性蛋白酶基因转化的宿主细菌的混合物，使氨肽酶基因和中性蛋白酶基因都得到表达，和收集培养混合物中产生的氨肽酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2007-10-29 2007-280200一种生产氨肽酶的方法，包含以下步骤用氨肽酶基因和用中性蛋白酶基因转化宿主细菌，或者用氨肽酶基因转化一部分宿主细菌而用中性蛋白酶基因转化另一部分宿主细菌，在培养基中培养用氨肽酶基因和用中性蛋白酶基因转化了的宿主细菌，或培养用氨肽酶基因转化的宿主细菌和用中性蛋白酶基因转化的宿主细菌的混合物，使氨肽酶基因和中性蛋白酶基因都得到表达，和收集培养混合物中产生的氨肽酶。2.根据权利要求1的生产方法，其中收集氨肽酶的步骤包括收集释放到培养上清液中 的氨肽酶。3.根据权利要求1或2的生产方法，其中氨肽酶基因和中性蛋白酶基因均是来源于属 于与宿主细菌所属种不同的种的细菌的基因。4.根据权利要求1到3中任一项所述的生产方法，其中氨肽酶基因和中性蛋白酶基因 都来源于属于一个和相同种的细菌。5.根据权利要求1到4中任一项所述的生产方法，其中氨肽酶基因是这样一种基因，其 编码的氨肽酶的特征是该氨肽酶导致的肽键切割反应在脯氨酸残基前的一个残基终止。6.根据权利要求述1到5中任一项所述的生产方法，其中氨肽酶基因和中性蛋白酶基 因都来源于溶蛋白弧菌(V. proteolyticus)。7.根据权利要求1到6中任一项所述的生产方法，其中宿主细菌是大肠杆菌。8.根据权利要求1到7中任一项所述的生产方法，其中当氨肽酶以其前蛋白原形式存 在时，具有如SEQ ID NO :4定义的氨基酸序列。9.根据权利要求1到8中任一项所述的生产方法，其中中性蛋白酶是弧菌溶血素。10.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：园田启之，大门克哉，杉村厚，
申请(专利权)人：日本化学研究株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]