本发明专利技术涉及新的可用于治疗艾滋病的重组表达载体、经改造细胞（特别是造血干细胞）和方法。本发明专利技术提供重组表达载体和经改造细胞（特别是造血干细胞），其可表达：（１）ＭＧＭＴ（Ｐ１４０Ｋ）基因；和（２）多个（特别是靶向ＨＩＶ的）ｓｉＲＮＡ和／或ｍｉＲＮＡｓ和／或核酶和／或反义寡核苷酸。本发明专利技术还提供治疗ＨＩＶ感染的方法，包括（１）制备本发明专利技术的细胞，然后将其移植到ＨＩＶ感染患者体内；和（２）进行适当的ＢＧ／ＢＣＮＵ治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因治疗领域，特别是可用于治疗艾滋病的重组表达载体、经改造细胞(特别是造血干细胞)和方法。
技术介绍
当前，对艾滋病毒(HIV)感染的治疗手段主要是高强度的抗逆转录病毒治疗，该疗法联合使用针对病毒逆转录酶和蛋白酶的抑制剂。不幸的是，HIV具有很高的突变率及复杂的致病机理，因此能够逃避治疗。由于HIV-1可以整合入细胞的基因组，病毒的基因组可长期存在于细胞之中。HIV-1在药物治疗之后仍可在携带HIV-1基因组的CD4+细胞再次激活扩增。因此，需要发展新的治疗手段对付HIV的感染。长期以来，将目的基因导入人类造血干细胞(HSC)以治疗人类疾病是众多科学家和医生期待实现的目标。然而，由于难于对足够数量的造血干细胞进行靶基因的转导，基因治疗至今无法在血细胞疾病治疗中得到应用。最近，出现了一种用P140K突变的O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶基因(P140K O6-methylguanine-DNA-methyltransferase，MGMT)作为抗性基因转导入细胞，然后用六氧苯甲基鸟嘌呤/卡莫司汀(O6-benzylguanine/1，3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea，BG/BCNU)杀死未带抗性基因的血液干细胞的筛选方法。化疗药物卡莫司汀(BCNU)是一种潜在的干细胞毒素，骨髓抑制是临床上观察到的BCDU治疗相关的剂量限制性毒性反应。六氧苯甲基鸟嘌呤(BG)本身并不杀伤干细胞，但能使干细胞对BCNU易感。联合使用BG和BCNU进行治疗可有效地在体内清除造血干细胞。表达MGMT(P140K)的造血干细胞在体内和体外对BG/BCNU联合治疗手段均呈现出抗性。基于以上原理，人们可以在体外改造血液干细胞，同时使其携带MGMT(P140K)基因。在这些改造好的血液干细胞移入体内之后，使用BG/BCNU。BG/BCNU将除去那些不带有MGMT(P140K)基因的血液干细胞，而携带MGMT(P140K)基因的血液干细胞将生存、扩增，最终取代原来的血液干细胞。此原理的可行性已在包括狗在内的大动物实验得以证实。(Neff T等，临床研究杂志，2003年，112卷1581-1588页)。运用非肥胖型糖尿病/严重免疫缺陷型小鼠(NOD/SCID小鼠)模型，人们已经证明携带MGMT(P140K)基因的人的血液干细胞可以在体内抗BG/BCNU毒性，从而生存、扩增(Zielske SP等，临床研究杂志，2003年，112卷1561-1570页)。该选择系统也可能可用于人类疾病治疗，使基因治疗得以在自体或异体骨髓移植中实现。RNA干扰(RNAi)是一种抑制基因表达机制，通过21～23个核苷酸长度的双链短干扰RNA(siRNA)介导mRNA的序列特异性降解。已证明靶向HIV-1mRNA的siRNA可在组织培养细胞中有效抑制HIV-1(Martinez MA等，免疫学趋势，2002年，23卷559-561页)。但不幸的是，在长期实验中发现HIV-1可对单一种类的siRNA抑制产生抗性(Das AT等，病毒学杂志，2004年，78卷2601-2605页)。这也是由于HIV的高突变率造成的。克服这一困难的一个途径是采取一种联合治疗办法，即将多个不同的抗HIV的 siRNA同时导入以避免抗性突变逃避。然而，目前尚没有一种方法可以有效地同时向细胞中导入并表达多个siRNA。因此，本领域需要改良的治疗或改善HIV感染的方法。本专利技术满足了这一需要，并提供了用于该目的和其它目的的重组表达载体、改造的细胞如造血干细胞等。
技术实现思路
本专利技术一方面提供可表达多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的表达盒，其包含由共同的启动子(例如一个或几个启动子)控制的、多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或 miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列。在一个具体实施方案中，本专利技术的表达盒中所述编码核酸序列是通过在一个miRNA基因簇中将多个miRNA序列(例如miRNA17，18，19a，20，和19b-1)的编码序列替换为多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列而获得的。另一方面，本专利技术提供重组表达载体，其可表达(1)MGMT(P140K)基因；和(2)多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸。在一个实施方案中，本专利技术重组表达载体包含(1)MGMT(P140K)基因，该基因与表达控制序列可操作地连接，使得该基因可在动物细胞(特别是哺乳动物细胞，如人细胞，如哺乳动物干细胞，优选造血干细胞)中表达；和(2)多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列，这些编码核酸序列与表达控制序列可操作地连接，使得可在动物细胞(特别是哺乳动物细胞，如人细胞，如哺乳动物干细胞，优选造血干细胞)中表达所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸。在一个优选实施方案中，重组表达载体中所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列由共同的启动子控制表达。在另一个优选实施方案中，上述重组表达载体中所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列是通过在一个miRNA基因簇中将多个miRNA序列(例如miRNA 17，18，19a，20，和19b-1)的编码序列替换为多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列而获得的。本专利技术的重组表达载体可以是质粒载体或病毒载体，例如逆转录病毒载体，包括慢病毒载体。优选地，所述重组表达载体是逆转录病毒载体，更优选慢病毒载体(如慢病毒Xiada-1)。在再一个相关方面，本专利技术提供改造后的用于生产逆转录病毒载体(例如慢病毒载体，如慢病毒Xiada-1)的包装载体(如包装质粒)，其含有突变后的POL和GAG基因，特别地，POL和GAG基因可相互独立地具有如下突变GAG --------GAUUGUACUGAGAGACAGGCU------------突变为--------GACTGCACAGAACGTCAAGCA------------POL ---------GGGGCAGUAGUAAUACAAGAU-----------突变为---------GGCGCTGTTGTTATCCAGGAC-----------本专利技术还涉及转化或转染或转导了本专利技术重组表达载体的分离的细胞，包括原核细胞(如细菌细胞，如大肠杆菌细胞)和真核细胞(如真菌细胞，昆虫细胞，植物细胞，动物细胞，优选哺乳动物如人的细胞)。本专利技术还涉及包含上述细胞的组织和生物，如动物，优选非人哺乳动物。本专利技术还涉及包含本专利技术的细胞的药物组合物。本专利技术还涉及转化或转染或转导了本专利技术的包装载体(如包装质粒)的分离的细胞。本专利技术还涉及包含上述细胞的组织和生物，如动物，优选非人哺乳动物。另一方面，本专利技术还涉及一种经改造的细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞，优选干细胞，特别是造血干细胞，如CD34+细胞)，其可表达(1)本文档来自技高网...
【技术保护点】
可表达多个ｓｉＲＮＡ和／或ｍｉＲＮＡｓ和／或核酶和／或反义寡核苷酸的表达盒，其包含由共同的启动子（例如一个或几个启动子）控制的、多个（特别是靶向ＨＩＶ的）ｓｉＲＮＡ和／或ｍｉＲＮＡｓ和／或核酶和／或反义寡核苷酸的编码核酸序列。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏宁邵，史长平，林圣彩，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。