高赖氨酸玉米组合物及其检测方法技术

本文公开了检测提高赖氨酸的转基因事件存在的测定法，所述测定法是基于插入到玉米基因组中的外源ＤＮＡ构建体和所述插入位点侧翼的基因组序列的ＤＮＡ序列之上的。还提供了具有表达二氢吡啶二羧酸合酶的新型外源ＤＮＡ构建体的转基因植物，所述二氢吡啶二羧酸合酶的活性导致植物或植物产品中赖氨酸增多。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请在35USC§ 119(e)之下要求保护2003年12月11日递交的美国临时申请系列号的权益，特此将其全部内容并入作为参考。专利
本专利技术涉及植物分子生物学领域。更加具体地，本专利技术涉及具有提高的赖氨酸的转基因玉米，并且涉及鉴定提供提高的赖氨酸的特异性外源DNA的测定和方法。专利技术背景Zea mays, 一般称作玉米和玉蜀黍，是一种广泛用于动物饲养的谷物。所述谷物， 即，谷粒，对于猪、牛和家禽来说是蛋白质，淀粉，和油的来源。在混合谷物饲料来源的据信为必需的十种氨基酸中，玉米特别限定于赖氨酸，苏氨酸和甲硫氨酸中。这些氨基酸的缺乏，特别是赖氨酸，需要饲料玉米或玉米粗粉补充这些营养成分，经常是通过添加大豆粗粉来提供。提高玉米谷粒中赖氨酸的水平作为使种子或粗粉作为动物饲料更有营养的方法对于本领域将是有益的。为了利用分子生物学方法提高赖氨酸的水平，已经鉴定并使用了至少一种赖氨酸途径酶，即二氢吡啶二羧酸合酶(本文称作DHDPS)的反馈不敏感版本。在体外显示分离自大肠杆茵的细菌DHDPS基因对于由赖氨酸水平的提高而导致的抑制的敏感性要少大约200倍，并且当导入转基因烟草中时，大肠杆茵DHDPS基因的过表达导致叶组织中赖氨酸的水平提高(Glassman等，美国专利5，288, 300)。Falco等公开了在种子中具有提高水平的赖氨酸的转基因植物以及可用于生产这些转基因植物的基因(美国专利5，773，691 和6，459，019 ；美国专利申请公开号2003/0056242，将每一篇的全部内容并入本文作为参考)。在这些报告中，Falco等描述了来自大肠杆茵的反馈不敏感性DHDPS以及来自棒状杆菌属(Corynebacterium)的DHDPS (也称ScordapA)的分离和使用以生成在种子中具有提高水平的赖氨酸的转基因油菜籽，烟草，玉米和大豆植物。对于玉米，Falco等报道了相对于非转化谷粒用cordapA基因转化的谷粒中游离赖氨酸的大约130%的提高。能够不仅对于转基因本身，还能够对于其在宿主植物或种子基因组中的定位来检测特定转基因在植物或种子，或这些植物或种子的后代中的存在或缺失将是有益的.对于定位的鉴定进一步提供了转基因事件的鉴定，通过所述转基因事件遗传工程技术人员将转基因插入到植物或种子祖先植物中。专利技术概述本专利技术提供可用于产生转基因事件的构建体以及可用于鉴定特定转基因事件的材料和方法，所述转基因事件致成转基因植物，其比不包括所述构建体的近亲植物积聚更高水平的赖氨酸。具体地，本专利技术包括无标记的转基因玉米品系，其含有通过标准玉米转化作用导入的特异性外源DNA，本文称为“LY038事件”或“事件LY038”。本专利技术进一步提供在获自玉米植物，种子或组织样品的DNA中检测LY038事件的存在或缺失的方法。相对于祖先或其它基本上相关的植物包含事件LY038的本专利技术的玉米植物在谷粒中显示提高的赖氨酸。此外，本专利技术提供外源DNA构建体，包含玉米球蛋白1启动子，水稻肌动蛋白1内含子，玉米二氢吡啶二羧酸酯合酶叶绿体转送肽编码DNA分子，棒状杆菌吡啶二羧酸酯合酶编码 DNA分子，和玉米球蛋白13’非翻译区，当在转基因植物细胞和植物中被可操作地连接和表达时，其导致在谷粒或其部分或源自所述谷粒或植物的加工产物中赖氨酸含量提高。在另一个实施方案中，所述构建体进一步包含Iox位点，呈现为去除用来鉴定成功的转化株的标记基因的机制的组分。关于鉴定源自特定转基因事件的植物或种子，提供组合物和方法来检测来自包含事件LY038的新玉米植物的基因组插入区的存在，S卩，构建体在基因组中所处的位点。提供包含至少一部分插入到基因组中的外源DNA以及一部分来自在插入位点侧翼的玉米基因组的DNA(本文称为“连接序列”)的DNA分子。在本专利技术的又一个实施方案中，提供包含SEQ ID NO :1或2的至少大约20个碱基对的新DNA分子，其中分别包含碱基对1781-1782或200-201。本专利技术进一步提供通过利用 SEQ ID NOs :3和4的引物进行的DNA扩增而获得的具有SEQ ID NO :6的序列的扩增子的序列的DNA分子；以及与所述扩增子互补的杂交探针，具有SEQ ID NO :5及其互补体的序列。 具有SEQ ID NO :5或6的序列的DNA分子跨越外源性DNA和侧翼玉米基因组DNA之间的连接区并且当用于合适的分析性测试中时对于事件LY038DNA具有诊断性。跨越外源DNA/事件LY038的基因组插入区的连接区的本专利技术的其它优选DNA分子是具有SEQ ID NOs -.1,2, 和11，及其互补体的序列的分子。本专利技术的另一方面是包含这些分子的稳定转化的玉米植物或种子。当引物的长度允许引物在PCR反应中发挥功能并且特异性地扩增靶序列时就说引物“足够长”；大约11个核苷酸或更长的长度是足够的；更加优选大约18个核苷酸或更长，还要更加优选大约M个核苷酸或更长，甚至更加优选大约30个核苷酸足以进行并且特异性扩增靶序列。本领域技术人员将会知道甚至大于大约30个核苷酸长的引物能够被有用地用于PCR反应中，并且因此是足够长的。可以用于鉴定事件LY038的PCR引物包含足够长的SEQ IDNO 1的DNA序列的转基因部分和足够长的SEQ ID NO :1的5，侧翼玉米DNA序列，或足够长的SEQ ID NO :2的 DNA序列的转基因部分和足够长的SEQ ID NO :2的3，侧翼玉米DNA序列。这些引物可以用于PCR方法中以提供对于事件LY038及其后代为诊断性的DNA扩增子产物。能够产生对于事件LY038为诊断性的扩增予或探针的与任何合适长度的SEQ ID NOs :1和2同源或互补的PCR引物是本专利技术的另一方面。例如，无限制地，对于事件LY038为诊断性的优选的引物包括那些具有SEQ ID NO :3或4任一种序列的至少大约18个连续核苷酸的引物。利用对于事件LY038及其后代为诊断性的DNA引物生产的扩增子是本专利技术的一方面。对于事件 LY038为诊断性的优选的扩增子具有SEQ ID NO 6的序列。本专利技术的另一方面提供检测样品中相应于事件LY038的DNA的存在或缺失的方法。这些方法包括从玉米植物，种子或组织中获得DNA，将样品DNA与PCR引物组相接触，进行PCR并且检测扩增子的存在或缺失.对于事件LY038为诊断性的优选的PCR引物包括具有SEQ ID NO :3和4的序列的寡核苷酸引物，其产生具有例如SEQ IDNO :6的序列的LY038 事件特异性扩增予，其可以通过具有例如SEQID NO :5的序列的LY038事件特异性探针进行检测.表示事件LY038存在的探针与含有对于事件LY038特异性的DNA的扩增子的杂交可以通过核酸操作技术现有的任何适合方法进行检测，包括TaqMan 测定，DNA印迹斑点杂交法等分子生物学领城普通技术人员已知的方法。本领域技术人员将会知道扩增子的检测可以通过不涉及探针与扩增子杂交的检测方法来进行，如丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶分析.本领域技术人员还将知道所述引物和探针的长度和序列可以由SEQ ID N0s:3，4，和 5所给出的例示性序列而变化，并且依然产生对于事件LY038为诊断性的PCR扩增子，或扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ构建体，其包含下列可操作连接的排列：　　　　（ａ）含有玉米球蛋白１启动子的第一个ＤＮＡ片段；　　　　（ｂ）含有水稻肌动蛋白１内含子的第二个ＤＮＡ片段；　　　　（ｃ）含有编码玉米ＤＨＤＰＳ叶绿体转送肽的ＤＮＡ分子的第三个ＤＮＡ片段；　　　　（ｄ）含有编码棒状杆菌ＤＨＤＰＳ的ＤＮＡ分子的第四个ＤＮＡ片段；和　　　　（ｅ）含有玉米球蛋白１３’非翻译区的第五个ＤＮＡ片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：MA迪兹甘，DA沃伊尔斯，KP马罗伊，RA凯利，T马尔瓦，MH吕蒂，
申请(专利权)人：孟山都技术有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]