本发明专利技术涉及一种表达ｂＦＧＦ蛋白的腺病毒载体及其转化体，以及该载体的构建方法。由此方法获得的表达ｂＦＧＦ蛋白的重组腺病毒可以克服现有给药途径的一种或多种缺陷，安全有效地用于耳聋治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，特别涉及表达碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)蛋白的重组腺病毒载体、由其转化的宿主、其构 建方法及其在体内耳转染中的应用。
技术介绍
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是成纤维细胞生长因子家族中的一员。 其广泛分布于各种动物的各种组织内，具有促进细胞和组织的分裂生长、保护细 胞免受损伤等重要的生物学作用，而且由于bFGF的靶细胞范围也非常广泛，因 此，具有广阔的临床应用前景和可观的经济效益。神经营养因子的潜在治疗作用的细胞学基础主要是对这些因子在药理学和 基因分子水平上的表达和调控的研究。bFGF对神经元的营养和保护作用表明其 确实是一类新的神经营养因子。自从bFGF被提纯以来，有关bFGF的研究进展很 快，现在对于bFGF的理化性质、分子生物学特征、某些作用机制以及生物学功 能等已经基本上研究清楚。随着生物工程技术的发展，近年来已经能够大批量地 生产重组人bFGF，因此有关bFGF的研究已经开始向临床应用方向发展。bFGF在治疗感音神经性耳聋(Sensorineural Hearing Loss, SNHL)方面的作 用为临床应用提供了可行性依据。研究表明，包括表皮生长因子(EGF)、碱性 成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子(IGFs)等在内的许多细胞因子对毛细 胞再生具有促进作用，其中，bFGF是研究最多的一种生长因子。研究发现，当 毛细胞损伤后，支持细胞的bFGF受体(FGFR)的表达水平增高，处于待增殖状 态。细胞外bFGF可以与支持细胞表面的FGFR结合并激活FGFR，从而将促细胞 增殖的信息传递到细胞内，然后在细胞内发生磷酸化，信号蛋白被激活，使得聚 集在细胞核内的bFGF刺激核糖体基因的转录，从而导致细胞增殖。但是生长因子的给药途径还存在着许多问题。生长因子导入内耳的方法可以是直接注入至内 耳外淋巴间隙，此方法虽然起一定作用，但由于生长因子半衰期短，在体内作用 有一定的时限，其作用必然受到限制。而采用肌肉或腹腔内注射的生长因子很难 通过血迷路屏障到达内耳。因此，如何有效地通过生物载体将生长因子导入内耳， 在聋病的基因治疗方面是国际上热门的前沿课题。目前认为通过腺病毒基因转移的方法是一种最理想且有效的途径。腺病毒具 有感染率高(可达100%)、能感染分裂或不分裂的细胞、易于增殖和纯化、滴 度高以及不整合到宿主细胞基因组内而相对安全等特点，从而显示出较好的应用 前景。耳蜗是基因治疗较为适合的靶器官，单一位点的接种就能使生长因子通过 耳蜗液扩散到整个耳蜗，并且耳蜗骨壁可以防止其传播到邻近组织，所引起的免 疫反应也比在其它组织中小。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种表达bFGF蛋白的腺病毒载体及其转化体。 本专利技术的另一个目的在于提供表达bFGF蛋白的腺病毒载体的构建方法。 根据本专利技术的一个方面，提供了表达bFGF蛋白的腺病毒载体，其利用基因工程方法，通过将编码bFGF蛋白的基因有效地与表达载体pAdeno-X重组而获得，所述载体具有图l所示的结构。根据本专利技术的另一方面，提供了表达bFGF蛋白的转化体，其利用本专利技术的表达bFGF蛋白的载体转化腺病毒而获得。由此方法获得的表达bFGF蛋白的重组腺病毒可以克服现有给药途径的一种或多种缺陷，安全有效地用于耳聋治疗。 根据本专利技术的再一方面，提供了表达bFGF蛋白的腺病毒载体的构建方法，其包括下述步骤(1) 将编码bFGF蛋白的基因有效地与表达载体pCI-neo重组，获得重组质粒 pCI-bFGF，其具有图2所示的结构；(2) 将步骤(1)的重组质粒pCI-bFGF有效地与穿梭表达载体pshuttle 2重组， 获得穿梭载体pshuttle2-bFGF，其具有图3所示的结构；(3) 将步骤(2)的穿梭载体pshuttle2-bFGF与腺病毒表达载体pAdeno-X重组，获得腺病毒表达载体pAdeno-bFGF。 其中，所述步骤(1)包括下述步骤(1.1) 、根据人类bFGF cDNA序列(GenBank登录号J04513)设计RT-PCR 引物，上游引物序列为5'-GAATTCCACCATGGCAGCCGGGAGCATCA-3'，带 有EcoR I酶切位点，下游弓I物序列为5'-TCTAGATCAGCTCTTAGCAGACATT-GG-3'，带有XbaI的酶切位点。(1.2) 、从人胶质母细胞瘤细胞系BT325中提取总RNA，经变性后作为模板， 利用步骤l.l中合成的引物，通过RT-PCR技术扩增480bp长的bFGF cDNA。(1.3) 、将歩骤1.2中获得的PCR产物和表达载体pCI-neo分别用EcoRI和Xba I进行双酶切，经T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌五Co//. DH5a，经酶切鉴定 后获得重组质粒pCI-bFGF。所述步骤(2)包括将步骤(1 )中获得的含有目的基因bFGF的质粒pCI-bFGF 和穿梭表达载体pshuttle2分别用Nhel和Notl双酶切，经回收、连接后转化大肠杆 菌五Q //. DH 5a，提取质粒后获得腺病毒穿梭载体pshuttle 2-bFGF。所述步骤(3)包括将步骤2.1中制备的穿梭载体pshuttle 2-bFGF与腺病毒 表达载体pAdeno-X分别用PI-Scel和I-CeuI进行双酶切，经回收、连接、用SwaI 消化后，转化大肠杆菌五Co". DH 5a，提取质粒后获得腺病毒表达载体 pAdeno-bFGF 。根据本专利技术的再一方面，提供了制备表达bFGF蛋白的重组腺病毒的方法， 包括将根据本专利技术制备的腺病毒表达载体pAdeno-bFGF经Pac I酶切线性化后转 染HEK293细胞，离心后获得纯化的腺病毒质粒pAdeno- bFGF。所获得的腺病毒pAdeno- bFGF测定滴度后即可转染目标细胞。本方法采用将哺乳动物的表达盒直接在体外连接到病毒复制缺陷区即E1/E3 区，而非采用传统的同源重组的方法。这样能节省重组时间同时也达到了重组的 准确性。腺病毒由于去除了E1/E3区，所以可以携带长达8Kb的外源基因。另外由 于E1/E3区的缺陷，使病毒的安全性增加，即毒性降低，但不影响其感染性。在严格无菌条件下，将本专利技术的所获得的携带bFGF基因的腺病毒pAdeno-bFGF转染内耳，例如经完整圆窗膜或经耳蜗底转鼓阶打孔转染小鼠内耳。附图说明图1是本专利技术构建的表达载体pAdeno-bFGF的结构图； 图2是本专利技术构建的重组质粒pCI-bFGF的结构图； 图3是本专利技术构建的腺病毒穿梭载体pshuttle 2-bFGF的结构图； 图4是本专利技术获得的bFGF cDNA的序列；图5是本专利技术构建质粒pCI-bFGF的EcoR I和Xba I双酶切鉴定结果，M是分子 量梯度，泳道l表示质粒pCI-bFGF经EcoRI和Xbal双酶切释放的片段；图6是本专利技术构建质粒pshuttle 2-bFGF经Nhe I和Not I双酶切鉴定结果，泳道2 表示质粒pCI-bFGF经EcoR I和XbaI双酶切释放的片段，M是分子量梯度；图7是本专利技术经完整圆窗膜方法转染内耳的手术图谱；图8是本专利技术经鼓阶打孔转染内耳的手术图谱；本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达ｂＦＧＦ蛋白的腺病毒载体，通过将编码ｂＦＧＦ蛋白的基因有效地与表达载体ｐＡｄｅｎｏ－Ｘ重组而构建，其特征在于，其具有图１所示的结构。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨仕明，翟所强，郭维，胡吟燕，陈伟，申卫东，侯昭晖，韩东一，杨伟炎，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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