用于利用寡核苷酸编辑细胞中核酸的组合物和方法技术

本发明专利技术包括用于利用编辑寡核苷酸治疗医学病症或疾病的组合物和方法。编辑寡核苷酸在编辑部分的每侧上含有约10个至约50个核苷酸的寡核苷酸链，其可含有将活性编辑部分置于适当位置以与靶核酸杂交的糖或接头。编辑寡核苷酸还可含有来自基因组中的被靶向的序列的至少一种核苷酸序列变化。该方法包括利用编辑寡核苷酸修饰细胞内的基因组序列，而无需另外的蛋白质或核酸来辅助编辑过程。与未修饰的寡核苷酸或在每个末端具有三个硫代磷酸酯的寡核苷酸相比，编辑寡核苷酸可以包含增加寡核苷酸的核酸酶稳定性的主链修饰。

Composition and method for the use of oligonucleotides to edit nucleic acids in cells

The present invention includes compositions and methods for the use of edited oligonucleotides for the treatment of medical diseases or diseases. The editing oligonucleotides contain about 10 oligonucleotide chains to about 50 nucleotides on each side of the editing part, which contain some sugar or joints that match the active editing part with the target nucleic acid. The edited oligonucleotides can also contain at least one nucleotide sequence from the targeted sequence in the genome. The method includes modifying the genome sequence of the cells by editing oligonucleotides, without the need for another protein or nucleic acid to assist in the editing process. Compared with unmodified oligonucleotides or oligonucleotides with three phosphorothioates at each end, editing oligonucleotides can contain major chain modifications that increase the stability of oligonucleotide nucleases.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于利用寡核苷酸编辑细胞中核酸的组合物和方法相关申请的交叉引用以下申请要求临时专利申请系列号62/252,693(2015年11月9日提交)、62/180,175(2015年6月16日提交)、62/141,077(2015年3月31日提交)和62/091,027(2014年12月12日提交)的优先权。关于联邦资助的研究或开发的声明不适用对于联合研究协议的缔约方的名称不适用在光盘上提交的材料的引用并入不适用
本专利技术涉及修饰基因组或RNA的序列的寡核苷酸应用于人和动物治疗(包括体内和体外治疗应用)、美容程序(美容手术，cosmeticprocedure)、临床前开发、基础研究和用于农业以提高食品储备、改良动物品种的畜牧业(农场动物和其他驯养动物)以提供理想的特征以及能源生产的领域中的用途。
技术介绍
寡核苷酸化学和体内核酸递送技术在过去十年的发展已经开启了DNA和RNA修饰疗法的潜力。许多临床试验中的阳性数据和美国首例系统性反义药物Mipomersen(IsisPharmaceuticals，SanDiego，CA)的批准已进一步证明了寡核苷酸药物的临床应用。虽然已经证明使用治疗性寡核苷酸通过调节RNA水平抑制蛋白质表达的临床益处，但是核酸编辑或修复方法的临床潜力可能会超过这些抑制方法的临床潜力(T.M.Woolf,等人,PNASVol.92:8298-8302,1995和T.M.Woolf,Nat.BiotechVol.16:341-344,1998)。稳健的编辑技术平台能够实现突变DNA的位点特异性化学校正，保护性等位基因的产生或以其他方式产生针对研究、治疗、美容或农业目的所期望的在整个生物体、细胞或组织的基因组中的变化。这种平台作为对由基因点突变和其他基因病变引起的广泛疾病的治疗性干预以及潜在疗法将具有广泛应用。有两种常规的用核酸的序列编辑机制。这些机制是化学修饰和将核酸序列掺入靶。通过化学修饰机制，编辑寡核苷酸引起被靶向的核苷酸的化学修饰，使得被靶向的核苷酸的编码改变。第二种常规机制是将一种或多种寡核苷酸掺入靶RNA或DNA序列。在这种机制中，寡核苷酸通常被称为“供体”DNA。这种机制被不严格地称为同源重组(HR)或同源性定向修复，但也可以包括其他机制，诸如基因转换、反式剪接或链侵入后引发核酸合成。由下一代测序(NextGenerationSequencing)和SNP分析推动的关于遗传途径和分子途径的信息的激增已经提供了大量用于治疗性编辑的靶以治疗单基因疾病和多基因疾病。这些疾病的实例包括家族性阿尔茨海默病、高血压、高胆固醇、HIV(通过诱导CCR5突变)、镰状细胞性贫血症、肥胖症、糖尿病、某些形式的肌营养不良和许多先天性代谢缺陷(inbornerrorsofmetabolism)。DNA编辑修复的治疗潜力已经被有前景的数据证明。已经使用工程化的锌指核酸酶(SangamoBiosciences，Inc.，Richmond，CA)来治疗HIV并且外显子跳读反义吗啉(SareptaTherapeutics，Inc.，Cambridge，MA)和2'-O-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸(Prosensa，Leiden，TheNetherlands)已被用于治疗某些形式的杜氏肌营养不良。此外，用于提高编辑效率的CRISPR/Cas-9基因编辑方法已经产生了许多研究产品和在治疗应用方面的投入。Woolf等人在脊椎动物模型系统中首次证实了治疗性mRNA编辑(PNASVol.92：8298-8302，1995)。在该系统中，杜氏肌营养不良mRNA中的被靶向的终止密码子突变在靶位点处用编辑反义RNA通过双链体形成(duplexformation)来修饰。Woolf等人的工作诱导了限于特异性的编辑。Montiel等人(PNAS110(45)：18285-90，2013)证实了囊性纤维化的mRNA修复的相关机制，其中在哺乳动物细胞中实现了20％的校正。虽然这成功地证明了治疗性编辑的原理，但是Montiel的方法并不容易应用于临床应用。其主要原因是Montiel等人的方法需要通过基因治疗、mRNA治疗或其他方法将修饰的基因、mRNA或蛋白质引入细胞。因此，基因治疗和mRNA治疗所公认的所有已知的缺点也与Montiel的治疗编辑方法有关。在另一方法中，Singer等人(NucleicAcidsResearch，27(24)：38-45，1999)用与由RecA蛋白辅助的靶链杂交的烷基化寡聚物靶向DNA。在该研究中，反应性氮芥基通过氨基-丙基接头与入侵寡核苷酸的内部dU残基的5位缀合。并且在一个处理周期之后将复合物转染到哺乳动物细胞中时观察到高达50％的寡核苷酸与靶DNA序列交联并证实了高达2％的靶序列突变。然而，将入侵的寡核苷酸交联到靶DNA通常导致分布在DNA区域上的各种突变，并且可能导致复制的抑制。已经实现了反应性碱基修饰化学物质与寡核苷酸的缀合和对被靶向的dsDNA序列的序列特异性修饰(F.Nagatsugi，等人NucleicAcidsResearch，Vol.31(6):e31DOI:10.1093/nar/gng031，2003)。在本研究中，将2-氨基-6-乙烯基嘌呤核苷类似物合成地掺入三链形成寡核苷酸(TFO)中。该TFO与缓冲液中的靶DNA质粒反应，实现靶DNA序列的达25-40％的修饰。然后将这种交联的TFO和DNA靶的混合物转染到细胞中，并测定诱变水平。该研究证明了具有针对被靶向的碱基的某种特异性的被靶向的序列的位点特异性突变以及显著却低的效率(一次处理为0.3％)。然而，这种方法具有与Singer等人相同的缺点，因为其引起交联。Sasaki等人(J.Am.Chem.Soc.，126(29)：8864-8865，2004；还参见美国专利号7,495,095)开发了一种将一氧化氮(NO)递送到DNA序列的特异性胞嘧啶位点后对胞嘧啶碱基特异性脱氨基的方法。在该方法中，用S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺进行含有6-硫鸟嘌呤的寡脱氧核苷酸(ODN)的亚硝化。然后将所得的S-亚硝基硫鸟嘌呤用于进行链间NO转移反应，然后在靶位点脱氨基。观察到从dmC到dT的42％的转化率，而在靶位点处具有错配的dT、dA或dG的互补ODN未观察到NO转移反应(和脱氨基)。该技术需要非生理pH以允许反应发生，以及长的孵育时间，其不一定适用于治疗干预。此外，化学反应性寡核苷酸策略即使在细胞中有效，也需要复杂的化学合成，并且可能与非被靶向的细胞成分(包括不理想的DNA)有反应性。它们针对每种碱基变化还需要不同的靶向化学物质，并且仅适于转换而不适于颠换，这限制了它们的普遍应用。此外，该方法不修复缺失和插入，这是对其校正任何突变的普遍应用的进一步限制。尽管如此，这种化学修饰方法进行编辑具有如下的优点：其不需要向细胞添加外源蛋白质以便于编辑，并且其原则上可以与高度修饰的寡核苷酸主链一起使用，该主链可以允许更好的组织分布和细胞摄取。一个研究组在二十世纪九十年代用嵌合寡核苷酸构建体实现了编辑，然后在二十一世纪前10年用单链寡核苷酸构建体实现了编辑(Brachman和Kmiec，DNARepair4：445-457，2005)。在该编辑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修饰细胞或个体内的基因组序列的方法，其包括以下步骤：向所述细胞或所述个体引入单链的化学修饰的寡核苷酸，而无需另外的外源蛋白质或核酸来辅助编辑所述基因组序列，其中一种或多种所述修饰是一种或多种主链修饰、糖修饰和/或核碱基修饰，其中所述寡核苷酸与所述基因组序列中的靶序列基本上互补，其中与未修饰的寡核苷酸或每个末端上具有三个硫代磷酸酯的寡核苷酸相比，所述寡核苷酸的所述修饰通过增加核酸酶稳定性来提高编辑效率。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.12 US 62/091,027;2015.03.31 US 62/141,077;1.一种修饰细胞或个体内的基因组序列的方法，其包括以下步骤：向所述细胞或所述个体引入单链的化学修饰的寡核苷酸，而无需另外的外源蛋白质或核酸来辅助编辑所述基因组序列，其中一种或多种所述修饰是一种或多种主链修饰、糖修饰和/或核碱基修饰，其中所述寡核苷酸与所述基因组序列中的靶序列基本上互补，其中与未修饰的寡核苷酸或每个末端上具有三个硫代磷酸酯的寡核苷酸相比，所述寡核苷酸的所述修饰通过增加核酸酶稳定性来提高编辑效率。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述单链的化学修饰的寡核苷酸是包含药物载体的药物组合物。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述药物载体是水、盐水或生理缓冲盐水。4.一种改善需要针对医学病症的治疗的个体的健康的方法，其包括：向个体施用单链的化学修饰的寡核苷酸，而无需另外的蛋白质或核酸来辅助编辑所述基因组序列，其中所述修饰是硫代磷酸酯主链修饰，其中所述寡核苷酸与所述基因组序列中的靶序列互补，其中与未修饰的寡核苷酸或每个末端上具有三个硫代磷酸酯的寡核苷酸相比，所述寡核苷酸的所述修饰通过增加核酸酶稳定性来提高编辑效率。5.一种用于减少或消除需要针对医学病症的治疗的个体的所述病症的方法，其包括：向个体施用单链的化学修饰的寡核苷酸，而无需另外的蛋白质或核酸来辅助编辑所述基因组序列，其中所述修饰是硫代磷酸酯主链修饰，其中所述寡核苷酸与所述基因组序列中的靶序列互补，其中与未修饰的寡核苷酸或每个末端上具有三个硫代磷酸酯的寡核苷酸相比，所述寡核苷酸的所述修饰通过增加核酸酶稳定性来提高编辑效率。6.根据权利要求4-5所述的方法，其中，所述施用是通过肌内注射、腹膜内注射、皮下注射或静脉内注射。7.根据权利要求4-5所述的方法，其中，所述施用是通过透皮递送、雾化吸入、直肠栓剂或阴道栓剂。8.一种用于将靶核酸中的突变的核苷酸回复到野生型核苷酸的方法，其包括以下步骤：将单链的化学修饰的寡核苷酸施用至具有或疑似具有所述突变的核苷酸的细胞或个体，而无需另外的蛋白质或核酸来辅助编辑所述基因组序列，其中所述修饰是硫代磷酸酯主链修饰，其中所述寡核苷酸与所述基因组序列中的靶序列互补，其中与未修饰的寡核苷酸或每个末端上具有三个硫代磷酸酯的寡核苷酸相比，所述寡核苷酸的所述修饰通过增加核酸酶稳定性来提高编辑效率，以及其中将至少一个所述突变的核苷酸回复到所述野生型核苷酸。9.一种用于修饰靶核酸中突变的密码子的非突变核苷酸以产生野生型密码子的方法，其包括以下步骤：将单链的化学修饰的寡核苷酸施用至具有或疑似具有所述突变的密码子的个体，而无需另外的蛋白质或核酸来辅助编码所述基因组序列，其中所述修饰是硫代磷酸酯主链修饰，其中所述寡核苷酸与所述基因组序列中的靶序列互补，其中与未修饰的寡核苷酸或每个末端上具有三个硫代磷酸酯的寡核苷酸相比，所述寡核苷酸的所述修饰通过增加核酸酶稳定性来提高编辑效率，以及其中将所述突变的密码子修饰为所述野生型密码子。10.一种用于将靶核酸中的终止密码子转变为通读非野生型密码子的方法，其包括以下步骤：将单链的化学修饰的寡核苷酸施用至具有或疑似具有所述终止密码子的个体，而无需另外的蛋白质或核酸来辅助编辑所述基因组序列，其中所述修饰是硫代磷酸酯主链修饰，其中所述寡核苷酸与所述基因组序列中的靶序列互补，其中与未修饰的寡核苷酸或每个末端上具有三个硫代磷酸酯的寡核苷酸相比，所述寡核苷酸的所述修饰通过增加核酸酶稳定性来提高编辑效率，以及其中将所述终止密码子修饰为所述通读非野生型密码子。11.一种用于修饰靶核酸中突变的密码子以产生导致非致病氨基酸的非野生型密码子的方法，其包括以下步骤：将单链的化学修饰的寡核苷酸施用至具有或疑似具有所述突变的密码子的个体，而无需另外的蛋白质或核酸来辅助编辑所述基因组序列，其中所述修饰是硫代磷酸酯主链修饰，其中所述寡核苷酸与所述基因组序列中的靶序列互补，其中与未修饰的寡核苷酸或每个末端上具有三个硫代磷酸酯的寡核苷酸相比，所述寡核苷酸的所述修饰通过增加核酸酶稳定性来提高编辑效率，以及其中将所述突变的密码子修饰为导致非致病氨基酸的非野生型密码子。12.一种用于修饰编码蛋白质的核酸以调节所述蛋白质的活性的方法，其包括以下步骤：向个体施用单链的化学修饰的寡核苷酸，而无需另外的外源蛋白质或核酸来辅助编辑所述基因组序列，其中所述修饰是硫代磷酸酯主链修饰，其中所述寡核苷酸与所述基因组序列中的靶序列互补，其中与未修饰的寡核苷酸或每个末端上具有三个硫代磷酸酯的寡核苷酸相比，所述寡核苷酸的所述修饰通过增加核酸酶稳定性来提高编辑效率，以及其中所述蛋白质的活性被调节。13.一种用于修饰编码突变蛋白质的核酸以抑制其致病影响的方法，其包括以下步骤：向个体施用单链的化学修饰的寡核苷酸，而无需另外的外源蛋白质或核酸来辅助编辑所述基因组序列，其中所述修饰是硫代磷酸酯主链修饰，其中所述寡核苷酸与所述基因组序列中的靶序列互补，其中与未修饰的寡核苷酸或每个末端上具有三个硫代磷酸酯的寡核苷酸相比，所述寡核苷酸的所述修饰通过增加核酸酶稳定性来提高编辑效率，以及其中所述突变蛋白质的致病影响被减少、抑制或消除。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述疾病是β地中海贫血、囊性纤维化、杜氏肌营养不良症或Hurler综合征。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述医学病症选自由阿尔茨海默病、乳腺癌易感性突变、囊性纤维化δ508突变、2型糖尿病(靶基因PTP-1B)、家族性自主神经功能障碍、家族性高胆固醇血症(PCSK9)、卵巢癌易感性突变、镰状细胞病和脊髓性肌肉萎缩症组成的组。16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述医学病症是2型糖尿病并且编辑寡核苷酸靶向PTP-1B基因。17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述镰状细胞病是镰状细胞性贫血症。18.根据权利要求14所述的方法，其中，所述医学病症选自由腺苷脱氨酶缺乏症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、淀粉样蛋白病、贝克肌营养不良症、Canavan病、腓骨肌萎缩症、囊性纤维化、1型糖尿病、杜氏肌营养不良症、法布里病、家族性腺瘤性息肉病、家族性淀粉样性心肌病、家族性淀粉样多发性神经病、弗里德希氏共济失调、戈谢病I型、戈谢病II型、糖原贮积病II型、GM2神经节苷脂沉积症、血色素沉着病、血友病A型、血友病B型、血友病C型、己糖胺酶A缺乏症、苯丙酮尿症、多囊肾病、朊病毒病、老年性系统性淀粉样变性病、Smith-Lemli-Opitz综...

【专利技术属性】
技术研发人员：托德·M·伍尔夫，亚历山大·列别杰夫，理查德·I·浩吉费，
申请(专利权)人：托德·M·伍尔夫，亚历山大·列别杰夫，理查德·I·浩吉费，
类型：发明
国别省市：美国,US