具有改变的PAM特异性的工程化CRISPR‑Cas9核酸酶制造技术

具有改变和改进的PAM特异性的工程化CRISPR‑Cas9核酸酶及其在基因组工程、表观遗传学工程和基因组靶向中的用途。

With the change of PAM specific engineering CRISPR Cas9 nuclease

With the change and improvement of PAM specific engineering CRISPR Cas9 nuclease and its use in genome engineering, epigenetic and genomic targeting in engineering.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改变的PAM特异性的工程化CRISPR-Cas9核酸酶优先权声明本申请要求于2015年3月3日提交的美国临时专利申请序列号61/127,634、在2015年5月22日提交的62/165,517、在2015年10月9日提交的62/239,737、以及在2015年11月20日提交的62/258,402的权益。以上文献的全部内容通过引用特此结合。联邦资助的研究或开发本专利技术是根据由国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的授权号DP1GM105378、NIHR01GM107427、和R01GM088040在政府支持下完成的。政府在本专利技术中享有一定的权利。
本专利技术至少部分地涉及具有改变和改进的原型间隔子邻近基序(PAM)特异性的工程化规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)核酸酶及其在基因组工程、表观基因组工程和基因组靶向中的用途。
技术介绍
CRISPR-Cas9核酸酶能够在广泛多样的生物体和细胞类型中实现高效、可定制的基因组编辑(Sander&Joung,NatBiotechnol[自然生物技术]32,347-355(2014)；Hsu等人,Cell[细胞]157,1262-1278(2014)；Doudna&Charpentier,Science[科学]346,1258096(2014)；Barrangou&May,ExpertOpinBiolTher[生物疗法的专家意见]15,311-314(2015))。Cas9的靶位点识别是由两个被称为crRNA和tracrRNA的短RNA引导(Deltcheva等人,Nature[自然]471,602-607(2011)；Jinek等人,Science[科学]337,816-821(2012))，它们可以融合成嵌合单个指导RNA(sgRNA)(Jinek等人,Science[科学]337,816-821(2012)；Jinek等人,Elife2,e00471(2013)；Mali等人,Science[科学]339,823-826(2013)；Cong等人,Science[科学]339,819-823(2013))。sgRNA(衍生自crRNA)的5'末端可以与靶DNA位点碱基配对，从而允许通过Cas9/sgRNA复合物对位点特异性切割进行直接重新编程(Jinek等人,Science[科学]337,816-821(2012))。然而，Cas9还必须识别位于与sgRNA碱基配对的DNA的近端的特异性原型间隔子邻近基序(PAM)(Mojica等人,Microbiology[微生物学]155,733-740(2009)；Shah等人,RNABiol[RNA生物学]10,891-899(2013)；Jinek等人,Science[科学]337,816-821(2012)；Sapranauskas等人,NucleicAcidsRes[核酸研究]39,9275-9282(2011)；Horvath等人,JBacteriol[细菌学杂志]190,1401-1412(2008))，这是启动序列特异性识别所需的要求(Sternberg等人,Nature[自然]507,62-67(2014))，但也可以限制这些核酸酶用于基因组编辑的靶向范围。广泛使用的化脓链球菌Cas9(SpCas9)识别短NGGPAM(Jinek等人,Science[科学]337,816-821(2012)；Jiang等人,NatBiotechnol[自然生物技术]31,233-239(2013))，每8bp的随机DNA序列发生一次。相比之下，迄今为止表征的其他Cas9直向同源物可以识别更长的PAM(Horvath等人,JBacteriol[细菌学杂志]190,1401-1412(2008)；Fonfara等人,NucleicAcidsRes[核酸研究]42,2577-2590(2014)；Esvelt等人,NatMethods[自然方法]10,1116-1121(2013)；Ran等人,Nature[自然]520,186-191(2015)；Zhang等人,MolCell[分子细胞]50,488-503(2013))。例如，金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)，即更适合于病毒递送的几种较小的Cas9直向同源物之一(Horvath等人,JBacteriol[细菌学杂志]190,1401-1412(2008)；Ran等人,Nature[自然]520,186-191(2015)；Zhang等人,MolCell[分子细胞]50,488-503(2013))，识别更长的NNGRRT(SEQIDNO:46)PAM，其预期在每32bp的随机DNA中发生一次。扩大Cas9直向同源物的靶向范围对于各种应用是重要的，包括修饰小遗传元件(例如，转录因子结合位点(Canver等人Nature[自然]；527(7577):192-7(2015)；Vierstra等人,NatMethods[自然方法]12(10):927-30(2015))或通过在PAM内定位序列差异来进行等位基因特异性改变(Courtney,D.G.等人GeneTher.[基因治疗]23(1):108-12(2015)。
技术实现思路
如此处所述，常规使用的化脓链球菌Cas9(SpCas9)和金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)被工程化为使用结构信息、基于细菌选择的定向进化和组合设计来识别新型PAM序列。这些改变的PAM特异性变体使得能够对野生型SpCas9或SaCas9无法有效靶向的斑马鱼和人类细胞中的内源性基因位点进行稳健的编辑。此外，我们鉴定和表征了另一种SpCas9变体，其在人类细胞中展现改进的PAM特异性，在具有非典型NAG和NGAPAM的位点上具有降低的活性。此外，我们发现两种具有完全不同的PAM特异性的较小尺寸的Cas9直向同源物嗜热链球菌Cas9(St1Cas9)和金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)在我们的细菌选择系统和人类细胞中有效起作用，这表明我们的工程策略可以延伸到来自其他物种的Cas9。我们的研究结果提供广泛有用的SpCas9和SaCas9变体，在此统称为“变体”或“这些变体”。在第一方面，本专利技术提供在以下位置中的一个或多个处具有突变的分离的化脓链球菌Cas9(SpCas9)蛋白：G1104、S1109、L1111、D1135、S1136、G1218、N1317、R1335、T1337，例如，包含与SEQIDNO:1的氨基酸序列至少80％一致的序列。在一些实施例中，变体SpCas9包含以下突变中的一个或多个：G1104K；S1109T；L1111H；D1135V；D1135E；D1135N；D1135Y；S1136N；G1218R；N1317K；R1335E；R1335Q；以及T1337R。在一些实施例中，变体SpCas9包含以下突变：D1135；D1135V/R1335Q/T1337R(VQR变体)；D1135E/R1335Q/T1337R(EQR变体)；D1135V/G1218/R1335Q/T1337R(VRQR变体)；D113本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的化脓链球菌Cas9(SpCas9)蛋白，其在以下位置中的一个或多个处具有突变：G1104、S1109、L1111、D1135、S1136、G1218、N1317、R1335、T1337。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.03 US 62/127,634;2015.05.22 US 62/165,517;1.一种分离的化脓链球菌Cas9(SpCas9)蛋白，其在以下位置中的一个或多个处具有突变：G1104、S1109、L1111、D1135、S1136、G1218、N1317、R1335、T1337。2.如权利要求1所述的分离的蛋白，其包含与SEQIDNO:1的氨基酸序列至少80％一致的序列。3.如权利要求1所述的分离的蛋白，其包含以下突变中的一个或多个：G1104K；S1109T；L1111H；D1135V；D1135E；D1135N；D1335Y；S1136N；G1218R；N1317K；R1335E；R1335Q；以及T1337R。4.如权利要求1-3所述的分离的蛋白，其包含以下突变：D1135E(D1135E变体)；D1135V/R1335Q/T1337R(VQR变体)；D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R(VRQR变体)；D1135E/R1335Q/T1337R(EQR变体)；D1135N/G1218R/R1335Q/T1337R(NRQR变体)；D1135Y/G1218R/R1335Q/T1337R(YRQR变体)；G1104K/D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R(KVRQR变体)；S1109T/D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R(TVRQR变体)；L1111H/D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R(HVRQR变体)；D1135V/S1136N/G1218R/R1335Q/T1337R(VNRQR变体)；D1135V/G1218R/N1317K/R1335Q/T1337R(VRKQR变体)；或D1135V/G1218R/R1335E/T1337R(VRER变体)。5.如权利要求1所述的分离的蛋白，其还包含降低核酸酶活性的选自下组的一个或多个突变，该组由以下各项组成：在D10、E762、D839、H983或D986处的突变；以及在H840或N863处的突变。6.如权利要求5所述的分离的蛋白，其中这些突变是：(i)D10A或D10N，和(ii)H840A、H840N、或H840Y。7.一种在以下位置中的一个或多个处具有突变的分离的金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)蛋白：E782、N968和/或R1015。8.如权利要求7所述的分离的蛋白，其包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列至少80％一致的序列。9.如权利要求7所述的分离的蛋白，其包含以下突变中的一个或多个：R1015Q、R1015H、E782K、N968K、E735K、K929R、A1021T、K1044N、E782K/N968K/R1015H(KKH变体)；E782K/K929R/R1015H(KRH变体)；或E782K/K929R/N968K/R1015H(KRKH变体)。10.如权利要求7所述的分离的蛋白，其还包含降低核酸酶活性的选自下组的一个或多个突变，该组由以下各项组成：在D10、D556、H557和/或N580处的突变。11.如权利要求7所述的分离的蛋白，其中这些突变是D10A、D556A、H557A、N580A，例如D10A/H557A和/或D10A/D556A/H557A/N580A。12.一种包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·K·乔昂格，B·克莱因斯蒂弗，
申请(专利权)人：通用医疗公司，
类型：发明
国别省市：美国,US